ISO 16212:2008
(Main)Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
ISO 16212:2008 gives general guidelines for enumeration of yeast and mould present in cosmetics, by counting the colonies on selective agar medium after aerobic incubation. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis, so as to determine the types of cosmetic products to which ISO 16212:2008 is applicable. Products considered to present a low microbiological risk include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des moisissures
L'ISO 16212:2008 donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures et des moisissures présentes dans les cosmétiques par comptage des colonies en milieu gélosé sélectif après une incubation aérobie. Afin de garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse de risque microbiologique pour déterminer les types de produits cosmétiques auxquels l'ISO 16212:2008 s'applique. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16212
First edition
2008-10-15
Cosmetics — Microbiology —
Enumeration of yeast and mould
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et des
moisissures
Reference number
ISO 16212:2008(E)
©
ISO 2008
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ISO 16212:2008(E)
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ISO 16212:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principles. 2
4.1 General. 2
4.2 Plate count. 2
4.3 Membrane filtration. 2
5 Diluents, neutralizers and culture media. 3
5.1 General. 3
5.2 Neutralizing diluents and diluents . 3
5.3 Diluent for yeast suspension (tryptone sodium chloride solution). 4
5.4 Culture media . 4
6 Apparatus and glassware . 5
7 Strain of microorganisms . 5
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples . 6
9 Procedure . 6
9.1 General recommendation . 6
9.2 Preparation of the initial suspension. 6
9.3 Counting methods . 6
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods). 7
11 Expression of results . 8
11.1 Method of calculation for plate count. 8
11.2 Interpretation. 8
12 Neutralization of the antifungicidal properties of the product. 10
12.1 General. 10
12.2 Preparation of inoculum . 10
12.3 Validation of counting methods. 11
13 Test report . 12
Annex A (informative) Other neutralizing diluents . 13
Annex B (informative) Other diluents. 15
Annex C (informative) Other culture media . 16
Annex D (informative) Neutralizers of antifungicidal activity of preservatives and rinsing liquids . 18
Bibliography . 19
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ISO 16212:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16212 was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Comestics.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16212:2008(E)
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
1 Scope
This International Standard gives general guidelines for enumeration of yeast and mould present in cosmetics
by counting the colonies on selective agar medium after aerobic incubation.
In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate
microbiological risk analysis so as to determine the types of cosmetic products to which this International
Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological risk include those with low water
activity, hydro-alcoholic products, products with extreme pH values, etc.
Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not be
suited to some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products). Other methods (e.g.
automated) can be used for the test presented here provided that their equivalence has been demonstrated or
the method has been otherwise validated.
Yeast enumerated can be identified using suitable identification tests, for example tests described in the
standards listed in the Bibliography. Mould enumerated can be identified by other appropriate methods, if
necessary.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 21148, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the
determination of bactericidal, mycobactericidal, sporicidal and fungicidal activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
yeast
single-cell fungus, which multiplies mainly vegetatively by budding, able to grow under the test conditions
specified in this International Standard
3.2
mould
mycelium forming microfungus, including spores and conidia, able to grow under the test conditions specified
in this International Standard
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ISO 16212:2008(E)
3.3
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.4
sample
portion of the product (at least 1 g or 1 ml) which is used in the test to prepare the initial suspension
3.5
initial suspension
suspension (or solution) of a sample in a defined volume of an appropriate liquid (diluent, neutralizer, broth or
combination thereof)
3.6
sample dilution(s)
dilution(s) of the initial suspension
4 Principles
4.1 General
This method involves enumeration of colonies on a selective agar medium. The possible inhibition of fungal
growth by the sample shall be neutralized to allow the detection of viable microorganism (see Reference [2]).
In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the antifungicidal properties of the product
shall be checked and validated (see References [3], [5], [6]).
4.2 Plate count
Plate count consists of the following steps.
a) Preparation of poured plates or spread plates, using a specified culture medium, and inoculation of the
plates using a defined quantity of the initial suspension or dilution of the product.
b) Aerobic incubation of the plates at 25 °C ± 2,5 °C for 3 d to 5 d.
c) Counting of the number of colony-forming units (CFU) and calculation of the amount of yeast and mould
per millilitre or per gram of product.
NOTE An alternative condition for incubation is 22,5 °C ± 2,5 °C for 5 d to 7 d using the culture medium without
antibiotic.
4.3 Membrane filtration
Membrane filtration consists of the following steps.
a) Transfer of a suitable amount of the sample, prepared by a valid method, in the filtration apparatus,
wetted with a small volume of an appropriate sterile diluent. Immediate filtration and washing according to
the validated procedure. Transfer of the membrane filter on to the surface of the specified agar medium
as specified in ISO 21148.
b) Aerobic incubation of the membranes at 25 °C ± 2,5 °C for 3 d to 5 d.
c) Counting of the number of colony-forming units (CFU) and calculation of the amount of yeast and mould
per millilitre or per gram of product.
NOTE An alternative condition for incubation is 22,5 °C ± 2,5 °C for 5 d to 7 d using the culture medium without
antibiotic.
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ISO 16212:2008(E)
5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General
General specifications are given in ISO 21148. When water is mentioned in a formula, use distilled water or
purified water as specified in ISO 21148.
The following diluents, neutralizers and culture media are suitable for enumeration of yeasts and moulds.
Other diluents, neutralizers and culture media may be used if they have been demonstrated to be suitable for
use.
5.2 Neutralizing diluents and diluents
5.2.1 General
The diluent is used to disperse the sample. It may contain neutralizers if the sample to be tested has
antifungicidal properties. The efficacy of the neutralization shall be demonstrated before the determination of
the count (see Clause 12). Information relative to suitable neutralizers is given in Annex D.
5.2.2 Neutralizing diluent
5.2.2.1 Fluid casein digest-soy lecithin-polysorbate 20 medium (SCDLP 20 broth)
5.2.2.1.1 Composition
⎯ pancreatic digest of casein 20,0 g
⎯ soy lecithin 5,0 g
⎯ polysorbate 20 40 ml
⎯ water 960 ml
5.2.2.1.2 Preparation
Dissolve the polysorbate 20 in 960 ml of water by mixing while heating in a water bath at 49 °C ± 2 °C. Add
pancreatic digest of casein and soy lecithin. Heat for about 30 min to effect solution. Mix and dispense the
medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall
be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.2.2.2 Other neutralizing diluents
Other neutralizing diluents may be used as appropriate (see Annex A and Annex D).
5.2.3 Diluent
5.2.3.1 Fluid A
5.2.3.1.1 Composition
⎯ peptic digest of animal tissue 1,0 g
⎯ water 1 000 ml
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5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve 1 g of peptone in water to make 1 l. Heat with frequent agitation. Dispense into suitable containers.
Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization the pH shall be equivalent to 7,1 ± 0,2 when
measured at room temperature.
5.2.3.2 Other diluents
Other diluents may be used as appropriate (see Annex B).
5.3 Diluent for yeast suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.3.1 Composition
⎯ tryptone, pancreatic digest of casein 1,00 g
⎯ sodium chloride 8,50 g
⎯ water 1 000 ml
5.3.2 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize in
the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at
room temperature.
5.4 Culture media
5.4.1 General
Culture media may be prepared as follows, or from dehydrated culture media according to the manufacturer's
instructions. Ready-to-use media may be used when their composition and/or growth yields are comparable to
those of the formulae given herein.
5.4.2 Sabouraud dextrose chloramphenicol agar medium (SDCA)
5.4.2.1 Composition
⎯ dextrose 40,0 g
⎯ peptic digest of animal tissue 5,0 g
⎯ pancreatic digest of casein 5,0 g
⎯ chloramphenicol 0,050 g
⎯ agar 15,0 g
⎯ water 1 000 ml
5.4.2.2 Preparation
Dissolve the components (including the chloramphenicol) or the dehydrated complete medium in the water by
mixing while heating. Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for
15 min. After sterilization the pH shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room temperature.
NOTE For known and non-contaminated products (with bacteria), the media are used without chloramphenicol.
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ISO 16212:2008(E)
5.4.3 Other media
Other media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.4 Agar medium for cultivation of reference strain: Sabouraud dextrose agar medium (SDA)
5.4.4.1 Composition
⎯ dextrose 40,0 g
⎯ peptic digest of animal tissue 5,0 g
⎯ pancreatic digest of casein 5,0 g
⎯ agar 15,0 g
⎯ water 1 000 ml
5.4.4.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating. Dispense
the medium into suitable containers. Sterilize in an autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization the pH
shall be equivalent to 5,6 ± 0,2 when measured at room temperature.
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
7 Strain of microorganisms
For testing the efficacy of neutralizers, one yeast reference strain is used.
1) 2) 3) 4)
Candida albicans ATCC 10231 or equivalent strain (IP 48.72 or NCPF 3179 or NBRC 1594 or
5) 6)
KCTC 17205 or TISTR 5779) or other equivalent national collection strain.
The selected yeast strain being considered more susceptible to antifungicidal activity than moulds may be
accepted as representative of fungi (yeast and mould) for the validation of the methodology. However, in case
of specific needs, the test for the efficacy of neutralizers may be performed with an additional mould reference
[11]
strain, using a suitable protocol for the preparation of a calibrated inoculum (e.g. see EN 13624:2003 ,
5.4.1.4).
The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of reference strain.
The strain may be kept in the laboratory in accordance with EN 12353.
1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) IP = Institut Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi.
4) NBRC = National Biological Resource Center.
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture.
6) TISTR = Thailand Institute of Scientific and Technological Research.
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ISO 16212:2008(E)
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples
If necessary, store products to be tested at room temperature.
Do not incubate, refrigerate or freeze products (3.3) and samples (3.4) before or after analysis.
Sampling of cosmetic products to be analysed should be carried out as described in ISO 21148. Analyse
samples as described in ISO 21148 and according to the procedure described in Clause 9.
9 Procedure
9.1 General recommendation
Use sterile material, equipment and aseptic techniques to prepare the sample, initial suspension and dilutions.
In the case of the preparation of the initial suspension, the time that elapses between the end of the
preparation and the moment the inoculum comes into contact with the culture medium shall not exceed 45 min,
unless specifically mentioned in the established protocols or documents.
9.2 Preparation of the initial suspension
9.2.1 General
The initial suspension is prepared from a sample of at least 1 g or 1 ml of the well-mixed product under test.
Note S, the exact mass or volume of the sample.
The initial suspension is usually a 1:10 dilution. Larger volumes of diluent may be required if high levels of
contamination are expected and/or if antifungicidal properties are still present in the 1:10 dilution.
9.2.2 Water-miscible products
Transfer the sample, S, of product to an appropriate volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (see 5.2.2) or
diluent (see 5.2.3).
Note d, the dilution factor.
9.2.3 Water-immiscible products
Transfer the sample, S, of product to a suitable container containing a suitable quantity of solubilizing agent
(e.g. polysorbate 80 solution). Disperse the sample within the solubilizing agent and add an appropriate
volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (see 5.2.2) or diluent (see 5.2.3).
Note d, the dilution factor.
9.3 Counting methods
9.3.1 Dilutions for counting methods
Usually, the initial suspension is the first counted dilution. If needed, additional serial dilutions (e.g. 1:10
dilution) may be performed from the initial suspension using the same diluent (according to the expected level
of contamination of the product).
Generally, counting is performed using at least two Petri dishes, but it is possible to use only one Petri dish in
case of routine testing, or if counts are performed on successive dilutions of the same sample or according to
previous results.
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ISO 16212:2008(E)
9.3.2 Plate-count methods
9.3.2.1 Pour-plate method
In Petri dishes of 85 mm to 100 mm in diameter, add 1 ml of the initial suspension and/or sample dilution
prepared as validated (see Clause 12) and pour 15 ml to 20 ml of the melted agar medium (see 5.4.2) kept in
a water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the amount of agar medium is increased
accordingly.
Mix the initial suspension and/or sample dilution with the medium, carefully rotating or tilting the plates
sufficiently to disperse them. Allow the mixture in the Petri dishes to solidify on a horizontal surface at room
temperature.
9.3.2.2 Surface spread method
In Petri dishes of 85 mm to 100 mm in diameter, put 15 ml to 20 ml of the melted agar medium (see 5.4.2)
kept in a water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the volume of the agar is increased
accordingly.
Allow plates to cool and solidify, for example in a microbiological cabinet or in an incubator. Spread over the
surface of the medium a measured volume of not less than 0,1 ml of the initial suspension and/or sample
dilution prepared as validated (see Clause 12).
9.3.2.3 Membrane filtration method
Use a membrane having a nominal pore size u 0,45 µm.
Transfer a suitable amount of the initial suspension or of the sample dilution prepared as validated (preferably
representing at least 1 g or 1 ml of the product) on to the membrane.
Filter immediately and wash the membrane (follow the procedure developed during the validation,
see Clause 12).
Transfer the membrane on to the surface of the agar medium (see 5.4.2).
9.3.2.4 Incubation
Unless otherwise stated, invert the inoculated dishes and place them in the incubator set at 25 °C ± 2,5 °C for
3 d to 5 d or use the alternative condition (see Notes in 4.2 and 4.3). After incubation, the dishes shall, if
possible, be examined immediately. Alternatively, they may be stored, unless otherwise specified, for up to a
maximum of 24 h in the refrigerator at 5 °C ± 3 °C.
NOTE 1 In certain cases, where there is a potential for confusing particles from the product with counted colonies, it
can be useful to prepare duplicate dishes containing the same sample dilutions and agar medium which are stored in the
refrigerator for comparison with incubated dishes.
NOTE 2 An intermediate check can be performed where both yeast and mould are suspected.
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods)
After incubation, count the colonies:
⎯ in Petri dishes containing 15 colonies to 150 colonies; if less than 15 colonies are counted, see 11.2.3;
⎯ on membranes containing 15 colonies to 150 colonies; if less than 15 colonies are counted, see 11.2.3.
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11 Expression of results
11.1 Method of calculation for plate count
Calculate the number, N, of microorganisms present in the sample, S, using:
⎯ m, the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates (1),
⎯ c, the number of colonies counted on a single plate (2) or
⎯ wm, the weighted mean of the counts obtained from two successive dilutions (3),
according to the following formulae:
N = m/(V × d) (1)
N = c/(V × d) (2)
N = wm/(V × d) (3)
where:
m is the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates;
V is the volume of inoculum applied to each dish, in millilitres;
d is the dilution factor corresponding to the dilution made for the preparation of the initial suspension
(see 9.2) or for the first counted dilution;
c is the number of colonies counted on a single plate.
The weighted mean of the colonies counted from two successive dilutions, x , is given by:
c
Σc
x =
c
nn+ 0,1
()
12
where
Σc is the sum of colonies counted on all the dishes retained from two successive dilutions;
n is the number of dishes counted for the initial suspension (or for the first counted dilution);
1
n is the number of dishes counted for the 1:10 dilution of the initial suspension (or for the second
2
counted dilution).
Round off the result calculated to two significant figures. For this, if the last figure is below 5, the preceding
figure is not modified; if the last figure is 5 or more, the preceding figure is increased by one unit. Proceed
stepwise until two significant figures are obtained. Note the number, N, obtained.
11.2 Interpretation
11.2.1 The inherent variability of plate count should be taken into account. Two results should only be
considered different if the difference exceeds 50 % or, when expressed logarithmically, the difference exceeds
0,3 log.
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ISO 16212:2008(E)
For a count to be precise, only plates or membranes with more than 15 colonies and less than 150 colonies
shall be taken into account. Check that the counts are obtained from dilutions validated according to the
chosen method (see Clause 12).
11.2.2 Where the number of CFU is more than 15 and less than 150 on plates or membranes, express the
result as follows:
⎯ if S is at least 1 g or 1 ml, and V is at least 1 ml, the number of yeast and mould per millilitre or per gram
of the sample = N/S;
⎯ if S is less than 1 g or 1 ml, and/or V is less than 1 ml, the number of yeast and mould in the sample (note
the tested quantity of sample taking into account S and V) = N;
where S is the mass or the volume of the sample (see 9.2).
Express the result as a number between 1,0 and 9,9 multiplied by the appropriate power of 10 (see examples).
11.2.3 Where the number of CFU is less than 15 on plates or membranes, express the result as follows:
⎯ if S is at least 1 g or 1 ml, and V is at least 1 ml, the estimated number of yeast and mould per millilitre or
per gram of the sample = N/S;
⎯ if S is less than 1 g or 1 ml, and/or V is less than 1 ml, the estimated number of yeast and mould in the
sample = N;
where S is the mass or the volume of the sample (see 9.2).
Express the result as a number between 1,0 and 9,9 multiplied by the appropriate power of 10 (see examples).
11.2.4 Where no colony is observed, the result is reported as follows:
⎯ there is less than 1/d × V × S of yeast and mold per gram or millilitre of the product (S is at least 1 g or
1 ml);
⎯ there is less than 1/d × V of yeast and mould in the sample S (note the tested quantity of sample taking
into account S and V) (S is less than 1 g or 1 ml);
where
d is the dilution factor of the initial suspension (see 9.2);
V is 1 (for counting with the pour-plate method and for membrane filtration) or 0,1 (for the spread plate
method) (see example).
EXAMPLE 1 Two dishes for one dilution
−1
S = 1 g; V = 1; counts obtained for the dilution 10 : 38 and 42
−1) 2
(1) N = m/(V × d) = 40/(1 × 10 = 40/0,1= 400 or 4 × 10 yeast and mould per millilitre or per gram of the sample.
EXAMPLE 2 One dish for one dilution
−1
S = 1 g; V = 1; count obtained for the dilution 10 : 60
−1) 2
(2) N = c/(V × d) = 60/(1 × 10 = 60/0,1 = 600 or 6 × 10 yeast and mould per millilitre or per gram of the sample.
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ISO 16212:2008(E)
EXAMPLE 3 Two dishes for two dilutions
−2 −3
S = 1 g; V = 1; counts obtained for the dilution 10 : 235 and 282; for the dilution 10 : 31 and 39
−2
(3) N = wm/(V × d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1 × 2) × 10 = 587/0,022 = 26 682.
4
Rounding the result as specified above gives 27 000 or 2,7 × 10 yeast and mould per millilitre or per gram of the sample.
EXAMPLE 4 Two membrane filters for one dilution
−1
S = 1 g; V = 1; counts obtained for the dilution 10 : 18 and 22
−1) 2
(1) N = m/(V × d) = 20/(1 × 10 = 20/0,1= 200 or 2 × 10 yeast and mould per millilitre or per gram of the sample.
EXAMPLE 5 One membrane filter for one dilution
−1
S = 1 g; V = 1; count obtained for the dilution 10 : 65
−1) 2
(2) N = c/(V × d) = 65/(1 × 10 = 65/0,1 = 650 or 6,5 × 10 aerobic yeast and mould per millilitre or per gram of the
sample.
EXAMPLE 6 Two membrane filters for two dilutions
−1 −2
S = 1 g; V = 1; counts obtained for the dilution 10 : 121 and 105; for the dilution 10 : 15 and 25
−1
(3) N = wm/(V × d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1 × 2) × 10 = 266/0,22 = 1 209.
3
Rounding the result as specified above gives 1 200 or 1,2 × 10 yeast and mould
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16212
Première édition
2008-10-15
Version corrigée
2009-04-15
Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement des levures et des
moisissures
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
Numéro de référence
ISO 16212:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 16212:2008(F)
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ISO 16212:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principes. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri . 2
4.3 Filtration sur membrane. 2
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture. 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants . 3
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone chlorure de sodium) . 4
5.4 Milieux de culture. 4
6 Appareillage et verrerie. 5
7 Souches de micro-organismes . 5
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire . 6
9 Mode opératoire . 6
9.1 Recommandation générale. 6
9.2 Préparation de la suspension mère. 6
9.3 Méthodes de dénombrement. 6
10 Dénombrement des colonies (méthode de dénombrement sur gélose et méthode par
filtration sur membrane) . 8
11 Expression des résultats . 8
11.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose des boîtes de Petri . 8
11.2 Interprétation. 9
12 Neutralisation des propriétés fongicides du produit. 11
12.1 Généralités . 11
12.2 Préparation de l'inoculum. 11
12.3 Validation des méthodes de dénombrement . 11
13 Rapport d'essai . 12
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants . 13
Annexe B (informative) Autres diluants. 15
Annexe C (informative) Autres milieux de culture . 16
Annexe D (informative) Neutralisants de l'activité fongicide des conservateurs et des liquides de
rinçage . 18
Bibliographie . 19
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ISO 16212:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16212 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
«La présente version corrigée de l'ISO 16212:2008 inclut les corrections suivantes:
⎯ Le terme «comptage» a été remplacé dans tout le document par le terme «dénombrement»;
⎯ Des corrections rédactionnelles ont été apportées dans tout le document.»
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NORME INTERNATIONALE ISO 16212:2008(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et
des moisissures
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures
et des moisissures présentes dans les cosmétiques par dénombrement des colonies en milieu gélosé sélectif
après une incubation aérobie.
Afin de garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse
de risque microbiologique pour déterminer les types de produits cosmétiques auxquels la présente Norme
internationale s'applique. Les produits dont on considère qu'ils présentent un faible risque microbiologique
comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les produits ayant des
valeurs de pH extrêmes, etc.
En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d'application, la présente
méthode pourrait ne pas être adaptée en tout point à certains produits (par exemple à certains produits non
miscibles à l'eau). D'autres méthodes (par exemple automatisées) peuvent être utilisées pour l'essai présenté
ici sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été validée par ailleurs.
Les levures dénombrées peuvent être identifiées à l'aide d'essais d'identification appropriés, par exemple
ceux décrits dans les normes indiquées dans la Bibliographie. Les moisissures dénombrées peuvent être
identifiées en utilisant d'autres méthodes appropriées, si nécessaire.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d'essai utilisés
pour la détermination de l'activité bactéricide, mycobactéricide, sporicide et fongicide
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
levure
champignon unicellulaire qui se multiplie principalement de manière végétative en bourgeonnant, capable de
se développer dans les conditions d'essais spécifiées dans la présente Norme internationale
3.2
moisissure
mycélium formant des micromycètes, y compris les spores et les conidies, capable de se développer dans les
conditions d'essai spécifiées par la présente Norme internationale
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ISO 16212:2008(F)
3.3
produit
portion d'un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.4
échantillon
portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée lors de l'essai pour préparer la suspension mère
3.5
suspension mère
suspension (ou solution) d'un échantillon dans un volume défini d'un liquide approprié (diluant, agent
neutralisant, bouillon ou combinaison de ceux-ci)
3.6
dilution(s) de l'échantillon
dilution(s) de la suspension mère
4 Principes
4.1 Généralités
La présente méthode implique le dénombrement des colonies dans un milieu gélosé sélectif. L'inhibition
possible du développement fongique par l'échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection des
micro-organismes viables (voir la Référence [2]). Dans tous les cas et quelle que soit la méthodologie, la
neutralisation des propriétés fongicides du produit doit être vérifiée et validée (voir les Références [3], [5], [6]).
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri
Le dénombrement sur gélose comprend les étapes suivantes.
a) Préparation des géloses pour ensemencement en profondeur ou étalement en surface, à l'aide d'un
milieu de culture défini, et inoculation des boîtes avec une quantité définie de la suspension mère ou
d'une dilution du produit.
b) Incubation aérobie des géloses de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
c) Dénombrement du nombre d'unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures et de
moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d'incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
4.3 Filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes.
a) Transfert d'une quantité adaptée de l'échantillon préparé selon une méthode validée dans l'appareil de
filtration, humidifié avec un faible volume de diluant stérile approprié. Filtration immédiate et lavage selon
un mode opératoire validé. Transfert de la membrane filtrante à la surface du milieu gélosé spécifié,
comme indiqué dans l'ISO 21148.
b) Incubation aérobie des membranes de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
c) Dénombrement du nombre d'unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures et de
moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d'incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
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5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités
Les spécifications générales sont décrites dans l'ISO 21148. Lorsque de l'eau est mentionnée dans une
formule, utiliser de l'eau distillée ou purifiée, comme spécifié dans l'ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement des
levures et des moisissures. D'autres diluants et agents neutralisants ainsi que d'autres milieux de culture
peuvent être utilisés s'il a été démontré qu'ils sont adaptés pour cet emploi.
5.2 Diluants neutralisants et diluants
5.2.1 Généralités
Le diluant est utilisé pour disperser l'échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l'échantillon à
soumettre à essai a des propriétés fongicides. L'efficacité de la neutralisation doit être démontrée avant la
détermination de la concentration en micro-organismes (voir Article 12). Les informations relatives à des
agents neutralisants appropriés sont données dans l'Annexe D.
5.2.2 Diluants neutralisants
5.2.2.1 Milieu à la peptone de caséine, à la lécithine de soja et au polysorbate 20 (bouillon
SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Composition
⎯ peptone pancréatique de caséine 20,0 g
⎯ lécithine de soja 5,0 g
⎯ polysorbate 20 40 ml
⎯ eau 960 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d'eau en mélangeant pendant le chauffage au bain-marie à
49 °C ± 2 °C. Ajouter la peptone pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant environ
30 min pour obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant
effectué à température ambiante.
5.2.2.2 Autres diluants neutralisants
D'autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexes A et D).
5.2.3 Diluants
5.2.3.1 Liquide A
5.2.3.1.1 Composition
⎯ peptone pepsique de tissus animaux 1,0 g
⎯ eau 1 000 ml
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5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre 1 g de peptone dans l'eau pour obtenir 1 l. Chauffer en remuant fréquemment. Répartir dans des
récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de
7,1 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.3.2 Autres diluants
D'autres diluants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe B).
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone chlorure de sodium)
5.3.1 Composition
⎯ tryptone, peptone pancréatique de caséine 1,00 g
⎯ chlorure de sodium 8,50 g
⎯ eau 1 000 ml
5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en mélangeant pendant le chauffage. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2,
le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.4 Milieux de culture
5.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme suit ou à partir de milieux de culture déshydratés,
conformément aux instructions du fabricant. Les milieux prêts à l'emploi peuvent être utilisés lorsque leur
composition et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des formules indiquées ci-après.
5.4.2 Gélose Sabouraud au dextrose chloramphénicol (SDCA)
5.4.2.1 Composition
⎯ dextrose 40,0 g
⎯ peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
⎯ peptone pancréatique de caséine 5,0 g
⎯ chloramphénicol 0,050 g
⎯ gélose 15,0 g
⎯ eau 1 000 ml
5.4.2.2 Préparation
Dissoudre les composants (y compris le chloramphénicol) ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en
mélangeant pendant le chauffage. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à
121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à
température ambiante.
NOTE Pour les produits connus et non contaminés (par des bactéries) le milieu sera utilisé sans chloramphénicol.
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5.4.3 Autres milieux
D'autres milieux peuvent être utilisés, le cas échéant (voir Annexe C).
5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de la souche de référence: gélose Sabouraud au dextrose (SDA)
5.4.4.1 Composition
⎯ dextrose 40 g
⎯ peptone pepsique de tissus animaux 5,0 g
⎯ peptone pancréatique de caséine 5,0 g
⎯ gélose 15,0 g
⎯ eau 1 000 ml
5.4.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en mélangeant pendant le chauffage.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la
stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
6 Appareillage et verrerie
L'équipement de laboratoire, le matériel et la verrerie doivent être tels que décrits dans l'ISO 21148.
7 Souches de micro-organismes
Pour la validation des conditions de l'essai, une souche de levure de référence est utilisée.
1) 2) 3) 4)
Candida albicans ATCC 10231 ou une souche équivalente (IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594,
5) 6)
KCTC 7205, TISTR 5779) ou toute autre souche équivalente issue de collections nationales.
La souche de levure sélectionnée considérée comme étant plus sensible à l'activité fongicide que les
moisissures peut être acceptée comme représentative des champignons (levures et moisissures) pour la
validation de la méthode. Cependant, en cas de besoins spécifiques, l'essai d'efficacité des agents
neutralisants peut être réalisé avec une souche de référence supplémentaire de moisissure, en utilisant un
[11]
protocole approprié pour la préparation d'un inoculum calibré (par exemple, voir l'EN 13624:2003 , 5.4.1.4).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la souche
de référence.
La souche peut être conservée au laboratoire, conformément à l'EN 12353.
1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) IP = Institute Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi.
4) NBRC = National Biological Resource Centre.
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture.
6) TISTR = Thailand Institue of Scientific and Technological Research.
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8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire
Si nécessaire, conserver les produits à soumettre à essai à température ambiante.
Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits (3.3) et les échantillons (3.4) avant ou après analyse.
Il convient d'effectuer l'échantillonnage des produits cosmétiques à analyser comme décrit dans l'ISO 21148.
Analyser les échantillons comme décrit dans l'ISO 21148 et conformément au mode opératoire décrit dans
l'Article 9.
9 Mode opératoire
9.1 Recommandation générale
Utiliser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer
l'échantillon, la suspension mère et les dilutions. En cas de préparation d'une suspension mère, le temps qui
s'écoule entre la fin de la préparation et le moment où l'inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne
doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières mentionnées dans les protocoles ou documents
établis.
9.2 Préparation de la suspension mère
9.2.1 Généralités
La suspension mère est préparée à partir d'un échantillon d'au moins 1 g ou 1 ml du produit à analyser
préalablement mélangé avec soin.
Noter la masse ou le volume exact de l'échantillon, S.
La suspension mère est généralement une dilution 1:10. Des volumes plus importants de diluant peuvent être
requis si des niveaux de contamination élevés sont attendus et/ou si des propriétés fongicides persistent dans
la dilution 1:10.
9.2.2 Produits miscibles dans l'eau
Transférer l'échantillon, S, de produit dans un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant
(voir 5.2.2) ou de diluant (voir 5.2.3).
Noter, d, le facteur de dilution.
9.2.3 Produits non miscibles à l'eau
Transférer l'échantillon, S, de produit dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate d'agent
solubilisant (par exemple solution polysorbate 80). Disperser l'échantillon dans l'agent solubilisant et ajouter
un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (voir 5.2.2) ou de diluant (voir 5.2.3).
Noter le facteur de dilution, d.
9.3 Méthodes de dénombrement
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement
La suspension mère est généralement la première dilution dénombrée. Au besoin, d'autres dilutions (par
exemple dilution 1:10) peuvent être réalisées à partir de la suspension mère en utilisant le même diluant
(selon le niveau de contamination attendu pour le produit).
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Le dénombrement est généralement effectué en utilisant au moins deux boîtes de Petri. Il est cependant
possible d'utiliser une seule boîte de Petri dans le cas d'un essai de routine, ou si les dénombrements sont
réalisés sur des dilutions successives du même échantillon ou en fonction des résultats antérieurs.
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose
9.3.2.1 Méthode par ensemencement en profondeur
Dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de diamètre, ajouter 1 ml de suspension mère et/ou de la
dilution d'échantillon préparée tel que validé (voir Article 12) et verser de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé
(voir 5.4.2) maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des
boîtes de Petri plus grandes sont utilisées, la quantité de milieu gélosé est augmentée en conséquence.
Mélanger la suspension mère et/ou la dilution d'échantillon avec le milieu en faisant soigneusement tourner
ou en inclinant suffisamment les boîtes de manière à assurer la dispersion. Laisser le mélange se solidifier
dans les boîtes de Pétri sur une surface horizontale à température ambiante.
9.3.2.2 Méthode par étalement en surface
Dans des boîtes de Pétri de 85 mm à 100 mm de diamètre, verser 15 ml à 20 ml de gélose SDCA (voir 5.4.2)
maintenue en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Petri
plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de gélose en conséquence.
Laisser la gélose se refroidir et se solidifier, par exemple sous une hotte microbiologique ou dans un
incubateur. Étaler un volume mesuré supérieur ou égal à 0,1 ml de la suspension mère et/ou de la dilution
d'échantillon préparée tel que validé (voir Article 12) sur la surface du milieu.
9.3.2.3 Méthode par filtration sur membrane
Utiliser une membrane dont le diamètre des pores n'excède pas 0,45 µm.
Transférer sur la membrane une quantité appropriée de la suspension mère ou de la dilution d'échantillon
préparée selon une méthode validée (représentant de préférence au moins 1 g ou 1 ml de produit).
Filtrer immédiatement et laver la membrane (suivre le mode opératoire mis au point au cours de la validation,
voir Article 12).
Transférer la membrane sur la surface de gélose SDCA (voir 5.4.2).
9.3.2.4 Incubation
Sauf indication contraire, retourner les boîtes ensemencées et les placer dans l'incubateur de 3 jours à 5 jours
à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note de 4.2 et de 4.3). Après incubation, les boîtes doivent, si
possible, être examinées immédiatement. Autrement, elles peuvent être conservées au réfrigérateur à
5 °C ± 3 °C, au plus 24 h, sauf indication contraire.
NOTE 1 Dans certains cas, lorsqu'il y a un risque de confusion des particules du produit avec les colonies dénombrées,
il peut être utile de dupliquer des boîtes contenant les mêmes dilutions de l'échantillon et le même milieu gélosé, et de les
stocker au réfrigérateur à des fins de comparaison avec les boîtes incubées.
NOTE 2 Une vérification intermédiaire peut être effectuée lorsque la présence simultanée de levures et de moisissures
est suspectée.
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10 Dénombrement des colonies (méthode de dénombrement sur gélose et méthode
par filtration sur membrane)
Après incubation, dénombrer les colonies:
⎯ dans des boîtes de Petri contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont
dénombrées, voir 11.2.3;
⎯ sur des membranes contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont dénombrées,
voir 11.2.3.
11 Expression des résultats
11.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose des boîtes de Petri
Calculer le nombre, N, de micro-organismes présents dans l'échantillon, S, au moyen de
⎯ m, la moyenne arithmétique des dénombrements obtenus à partir des boîtes de Petri dupliquées (1),
⎯ c, le nombre de colonies comptées sur une seule boîte (2), ou
⎯ wm, la moyenne pondérée des dénombrements obtenus à partir de deux dilutions successives (3),
selon les formules suivantes:
N = m/(V × d) (1)
N = c/(V × d) (2)
N = wm/(V × d) (3)
où
m est la moyenne arithmétique des dénombrements obtenus à partir des boîtes de Petri dupliquées;
V est le volume d'inoculum introduit dans chaque boîte, en millilitres;
d est le facteur de dilution correspondant à la dilution réalisée pour la préparation de la suspension
mère (voir 9.2) ou pour la première dilution dénombrée;
c est le nombre de colonies dénombrées dans une seule boîte.
La moyenne pondérée des colonies dénombrées à partir de deux dilutions successives, x , est donnée par:
c
Σc
x =
c
()nn+ 0,1
12
où
Σc est la somme des colonies dénombrées dans toutes les boîtes retenues à partir de deux dilutions
successives;
n est le nombre de boîtes dénombré pour la suspension mère (ou pour la première dilution
1
dénombrée);
n est le nombre de boîtes dénombré pour la dilution 1:10 de la suspension mère (ou pour la deuxième
2
dilution dénombrée).
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Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour ce faire, si le dernier chiffre est inférieur à 5, le
chiffre précédent n'est pas modifié; si le dernier chiffre est égal ou supérieur à 5, le chiffre précédent est
augmenté d'une unité. Procéder ainsi par étapes jusqu'à obtenir deux chiffres significatifs. Noter le nombre, N,
obtenu.
11.2 Interprétation
11.2.1 Il convient de tenir compte de la variabilité inhérente du dénombrement sur gélose. Deux résultats
pourront être considérés comme différents seulement si leur différence n'excède pas 50 % ou, quand elle est
exprimée en log, seulement si elle dépasse 0,3 log.
Pour que le dénombrement soit précis, il convient de ne tenir compte que des géloses ou des membranes
ayant plus de 15 colonies et moins de 150 colonies. Vérifier que les dénombrements sont obtenus à partir de
dilutions validées selon la méthode sélectionnée (voir Article 12).
11.2.2 Lorsque le nombre d'UFC est supérieur à 15 et inférieur à 150 sur les géloses ou les
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16212
Première édition
2008-10-15
Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement des levures et des
moisissures
Cosmetics — Microbiology — Enumeration of yeast and mould
Numéro de référence
ISO 16212:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 16212:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principes. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Comptage sur gélose . 2
4.3 Filtration sur membrane. 2
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture. 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants . 3
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone chlorure de sodium) . 4
5.4 Milieux de culture. 4
6 Appareillage et verrerie. 5
7 Souches de micro-organismes . 5
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire . 6
9 Mode opératoire . 6
9.1 Recommandation générale. 6
9.2 Préparation de la suspension mère. 6
9.3 Méthodes de comptage. 6
10 Comptage des colonies (méthode de comptage sur gélose et méthode par filtration sur
membrane). 8
11 Expression des résultats . 8
11.1 Méthode de calcul pour le comptage sur gélose des boîtes de Petri . 8
11.2 Interprétation. 9
12 Neutralisation des propriétés fongicides du produit. 11
12.1 Généralités . 11
12.2 Préparation de l'inoculum. 11
12.3 Validation des méthodes de dénombrement . 11
13 Rapport d'essai . 12
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants . 13
Annexe B (informative) Autres diluants. 15
Annexe C (informative) Autres milieux de culture . 16
Annexe D (informative) Neutralisants de l'activité fongicide des conservateurs et des liquides de
rinçage . 18
Bibliographie . 19
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16212 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16212:2008(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement des levures et
des moisissures
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour le dénombrement des levures
et des moisissures présentes dans les cosmétiques par comptage des colonies en milieu gélosé sélectif après
une incubation aérobie.
Afin de garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse
de risque microbiologique pour déterminer les types de produits cosmétiques auxquels la présente Norme
internationale s'applique. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique
comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les produits ayant des
valeurs de pH extrêmes, etc.
En raison de la grande variété de produits cosmétiques couverts dans ce domaine d'application, la présente
méthode pourrait ne pas être adaptée en tout point à certains produits (par exemple à certains produits non
miscibles à l'eau). D'autres méthodes (par exemple automatisées) peuvent être utilisées pour l'essai présenté
ici sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été validée par ailleurs.
Les levures dénombrées peuvent être identifiées à l'aide d'essais d'identification appropriés, par exemple
ceux décrits dans les normes données dans la Bibliographie. Les moisissures dénombrées peuvent être
identifiées en utilisant d'autres méthodes appropriées, si nécessaire.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 21148, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d'essai utilisés
pour la détermination de l'activité bactéricide, mycobactéricide, sporicide et fongicide
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
levure
champignon unicellulaire qui se multiplie principalement de manière végétative en bourgeonnant, capable de
se développer dans les conditions d'essais spécifiées dans la présente Norme internationale
3.2
moisissure
mycélium formant des micromycètes, y compris les spores et les conidies, capable de se développer dans les
conditions d'essai spécifiées par la présente Norme internationale
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3.3
produit
portion d'un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
3.4
échantillon
portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée lors de l'essai pour préparer la suspension mère
3.5
suspension mère
suspension (ou solution) d'un échantillon dans un volume défini d'un liquide approprié (diluant, agent
neutralisant, bouillon ou combinaison de ceux-ci)
3.6
dilution(s) de l'échantillon
dilution(s) de la suspension mère
4 Principes
4.1 Généralités
La présente méthode implique le dénombrement des colonies dans un milieu gélosé sélectif. L'inhibition
possible du développement fongique par l'échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection des
micro-organismes viables (voir la Référence [2]). Dans tous les cas et quelle que soit la méthodologie, la
neutralisation des propriétés fongicides du produit doit être vérifiée et validée (voir les Références [3], [5], [6]).
4.2 Comptage sur gélose
Le comptage sur gélose comprend les étapes suivantes.
a) Préparation des boîtes pour ensemencement en profondeur ou étalement en surface, à l'aide d'un milieu
de culture défini, et inoculation des boîtes avec une quantité définie de la suspension mère ou d'une
dilution du produit.
b) Incubation aérobie des boîtes de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
c) Comptage du nombre d'unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures et de
moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d'incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
4.3 Filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes.
a) Transfert d'une quantité adaptée de l'échantillon préparé selon une méthode validée dans l'appareillage
de filtration, humidifié avec un faible volume de diluant stérile approprié. Filtration et lavage immédiats
selon un mode opératoire validé. Transfert de la membrane filtrante à la surface du milieu gélosé spécifié,
comme indiqué dans l'ISO 21148.
b) Incubation aérobie des membranes de 3 jours à 5 jours à 25 °C ± 2,5 °C.
c) Comptage du nombre d'unités formant colonie (UFC) et dénombrement du nombre de levures et de
moisissures par millilitre ou par gramme de produit.
NOTE Une condition d'incubation de 5 jours à 7 jours à 22,5 °C ± 2,5 °C en utilisant un milieu de culture sans
antibiotique est également possible.
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5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités
Les spécifications générales sont décrites dans l'ISO 21148. Lorsque de l'eau est mentionnée dans une
formule, utiliser de l'eau distillée ou purifiée, comme spécifié dans l'ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement des
levures et des moisissures. D'autres diluants et agents neutralisants ainsi que d'autres milieux de culture
peuvent être utilisés s'il a été démontré qu'ils sont adaptés pour cet emploi.
5.2 Diluants neutralisants et diluants
5.2.1 Généralités
Le diluant est utilisé pour disperser l'échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l'échantillon à
soumettre à essai a des propriétés fongicides. L'efficacité de la neutralisation doit être démontrée avant la
détermination de la concentration fongique (voir Article 12). Les informations relatives à des agents
neutralisants appropriés sont données dans l'Annexe D.
5.2.2 Diluants neutralisants
5.2.2.1 Milieu à la caséine, à la lécithine de soja et au polysorbate 20 (bouillon SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Composition
⎯ peptone pancréatique de caséine 20,0 g
⎯ lécithine de soja 5,0 g
⎯ polysorbate 20 40 ml
⎯ eau 960 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d'eau en mélangeant pendant le chauffage au bain-marie à
49 °C ± 2 °C. Ajouter la peptone pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant environ
30 min pour obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant
effectué à température ambiante.
5.2.2.2 Autres diluants neutralisants
D'autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexes A et D).
5.2.3 Diluants
5.2.3.1 Liquide A
5.2.3.1.1 Composition
⎯ peptone pepsique de tissus animaux 1,0 g
⎯ eau 1 000 ml
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5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre 1 g de peptone dans l'eau pour obtenir 1 l. Chauffer en remuant fréquemment. Répartir dans des
récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de
7,1 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.2.3.2 Autres diluants
D'autres diluants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe B).
5.3 Diluant pour la suspension de levure (solution tryptone chlorure de sodium)
5.3.1 Composition
⎯ tryptone, peptone pancréatique de caséine 1,00 g
⎯ chlorure de sodium 8,50 g
⎯ eau 1 000 ml
5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en mélangeant pendant le chauffage. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2,
le mesurage étant effectué à température ambiante.
5.4 Milieux de culture
5.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme suit ou à partir de milieux de culture déshydratés,
conformément aux instructions du fabricant. Les milieux prêts à l'emploi peuvent être utilisés lorsque leur
composition et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des formules indiquées ci-après.
5.4.2 Gélose Sabouraud au dextrose chloramphénicol (SDCA)
5.4.2.1 Composition
⎯ dextrose 40,0 g
⎯ peptone peptique de tissus animaux 5,0 g
⎯ peptone pancréatique de caséine 5,0 g
⎯ chloramphénicol 0,050 g
⎯ gélose 15,0 g
⎯ eau 1 000 ml
5.4.2.2 Préparation
Dissoudre les composants (y compris le chloramphénicol) ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en
mélangeant pendant le chauffage. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à
121 °C pendant 15 min. Après la stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à
température ambiante.
NOTE Pour les produits connus et non contaminés (par des bactéries) le milieu sera utilisé sans chloramphénicol.
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5.4.3 Autres milieux
D'autres milieux peuvent être utilisés, le cas échéant (voir Annexe C).
5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de la souche de référence: gélose Sabouraud au dextrose (SDA)
5.4.4.1 Composition
⎯ dextrose 40 g
⎯ peptone peptique de tissus animaux 5,0 g
⎯ peptone pancréatique de caséine 5,0 g
⎯ gélose 15,0 g
⎯ eau 1 000 ml
5.4.4.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau, en mélangeant pendant le chauffage.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après la
stérilisation, le pH doit être de 5,6 ± 0,2, le mesurage étant effectué à température ambiante.
6 Appareillage et verrerie
L'équipement de laboratoire, le matériel et la verrerie doivent être tels que décrits dans l'ISO 21148.
7 Souches de micro-organismes
Pour la validation des conditions d'essai, une souche de levure de référence est utilisée.
1) 2) 3) 4)
Candida albicans ATCC 10231 ou une souche équivalente (IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594,
5) 6)
KCTC 7205, TISTR 5779) ou toute autre souche équivalente issue de collections nationales.
La souche de levure sélectionnée considérée comme étant plus sensible à l'activité fongicide que les
moisissures peut être acceptée comme représentative des champignons (levures et moisissures) pour la
validation de la méthode. Cependant, en cas de besoins spécifiques, l'essai d'efficacité des agents
neutralisants peut être réalisé avec une souche de référence supplémentaire de moisissure, en utilisant un
[11]
protocole approprié pour la préparation d'un inoculum calibré (par exemple, voir l'EN 13624:2003 , 5.4.1.4).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la souche
de référence.
La souche peut être conservée au laboratoire, conformément à l'EN 12353.
1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) IP = Institute Pasteur.
3) NCPF = National Collection of Pathogenic Fungi.
4) NBRC = National Biological Resource Centre.
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture.
6) TISTR = Thailand Institue of Scientific and Technological Research.
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8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire
Si nécessaire, conserver les produits à soumettre à essai à température ambiante.
Ne pas incuber, réfrigérer ou congeler les produits (3.3) et les échantillons (3.4) avant ou après analyse.
Il convient d'effectuer l'échantillonnage des produits cosmétiques à analyser comme décrit dans l'ISO 21148.
Analyser les échantillons comme décrit dans l'ISO 21148 et conformément au mode opératoire décrit dans
l'Article 9.
9 Mode opératoire
9.1 Recommandation générale
Utiliser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer
l'échantillon, la suspension mère et les dilutions. En cas de préparation d'une suspension mère, le temps qui
s'écoule entre la fin de la préparation et le moment où l'inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne
doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières mentionnées dans les protocoles ou documents
établis.
9.2 Préparation de la suspension mère
9.2.1 Généralités
La suspension mère est préparée à partir d'un échantillon d'au moins 1 g ou 1 ml du produit à analyser
préalablement mélangé.
Noter la masse ou le volume exact de l'échantillon, S.
La suspension mère est généralement une dilution 1:10. Des volumes plus importants de diluant peuvent être
requis si des niveaux de contamination élevés sont attendus et/ou si des propriétés fongicides persistent dans
la dilution 1:10.
9.2.2 Produits solubles dans l'eau
Transférer l'échantillon, S, de produit dans un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant
(voir 5.2.2) ou de diluant (voir 5.2.3).
Noter, d, le facteur de dilution.
9.2.3 Produits insolubles à l'eau
Transférer l'échantillon, S, de produit dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate d'agent
solubilisant (par exemple solution polysorbate 80). Disperser l'échantillon dans l'agent solubilisant et ajouter
un volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (voir 5.2.2) ou de diluant (voir 5.2.3).
Noter le facteur de dilution, d.
9.3 Méthodes de comptage
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de comptage
La suspension mère est généralement la première dilution comptée. Au besoin, d'autres dilutions (par
exemple dilution 1:10) peuvent être réalisées à partir de la suspension mère en utilisant le même diluant
(selon le niveau de contamination attendu pour le produit).
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Le comptage est généralement effectué en utilisant au moins deux boîtes de Petri. Il est cependant possible
d'utiliser une seule boîte de Petri dans le cas d'un essai de routine, ou si les comptages sont réalisés sur des
dilutions successives du même échantillon ou en fonction des résultats antérieurs.
9.3.2 Méthodes de comptage sur gélose
9.3.2.1 Méthode par ensemencement en profondeur
Dans des boîtes de Petri de 85 mm à 100 mm de diamètre, ajouter 1 ml de suspension mère et/ou de la
dilution d'échantillon préparée tel que validé (voir Article 12) et verser de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé
(voir 5.4.2) maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des
boîtes de Petri plus grandes sont utilisées, la quantité de milieu gélosé est augmentée en conséquence.
Mélanger la suspension mère et/ou la dilution d'échantillon avec le milieu en faisant soigneusement tourner
ou en inclinant suffisamment les boîtes de manière à assurer la dispersion. Laisser le mélange se solidifier
dans les boîtes de Pétri sur une surface horizontale à température ambiante.
9.3.2.2 Méthode par étalement en surface
Dans des boîtes de Pétri de 85 mm à 100 mm de diamètre, verser 15 ml à 20 ml de gélose SDCA (voir 5.4.2)
maintenue en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Petri
plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de gélose en conséquence.
Laisser la gélose se refroidir et se solidifier, par exemple sous une hotte à flux laminaire ou dans un
incubateur. Étaler un volume mesuré supérieur ou égal à 0,1 ml de la suspension mère et/ou de la dilution
d'échantillon préparée tel que validé (voir Article 12) sur la surface du milieu.
9.3.2.3 Méthode par filtration sur membrane
Utiliser une membrane dont le diamètre des pores ne dépasse pas 0,45 µm.
Transférer sur la membrane une quantité appropriée de la suspension mère ou de la dilution d'échantillon
préparée selon une méthode validée (représentant de préférence au moins 1 g ou 1 ml de produit).
Filtrer immédiatement et laver la membrane (suivre le mode opératoire mis au point au cours de la validation,
voir Article 12).
Transférer la membrane sur la surface de gélose SDCA (voir 5.4.2).
9.3.2.4 Incubation
Sauf indication contraire, retourner les boîtes ensemencées et les placer dans l'incubateur de 3 jours à 5 jours
à 25 °C ± 2,5 °C ou autre condition (voir la Note de 4.2 et de 4.3). Après incubation, les boîtes doivent, si
possible, être examinées immédiatement. Autrement, elles peuvent être conservées au réfrigérateur à
5 °C ± 3 °C, au plus 24 h, sauf indication contraire.
NOTE 1 Dans certains cas, lorsqu'il y a un risque de confusion des particules du produit avec les colonies dénombrées,
il peut être utile de dupliquer des boîtes contenant les mêmes dilutions de l'échantillon et le même milieu gélosé, et de les
stocker au réfrigérateur à des fins de comparaison avec les boîtes incubées.
NOTE 2 Une vérification intermédiaire peut être effectuée lorsque la présence simultanée de levures et de moisissures
est suspectée.
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10 Comptage des colonies (méthode de comptage sur gélose et méthode par
filtration sur membrane)
Après incubation, compter les colonies:
⎯ dans des boîtes de Petri contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont
dénombrées, voir 11.2.3;
⎯ sur des membranes contenant de 15 colonies à 150 colonies; si moins de 15 colonies sont dénombrées,
voir 11.2.3.
11 Expression des résultats
11.1 Méthode de calcul pour le comptage sur gélose des boîtes de Petri
Calculer le nombre, N, de micro-organismes présents dans l'échantillon, S, au moyen de
⎯ m, la moyenne arithmétique des comptages obtenus à partir des boîtes de Petri dupliquées (1),
⎯ c, le nombre de colonies comptées sur une seule boîte (2), ou
⎯ wm, la moyenne pondérée des comptages obtenus à partir de deux dilutions successives (3),
selon les équations suivantes:
N = m/(V × d) (1)
N = c/(V × d) (2)
N = wm/(V × d) (3)
où
m est la moyenne arithmétique des compatges obtenus à partir des boîtes de Petri dupliquées;
V est le volume d'inoculum introduit dans chaque boîte, en millilitres;
d est le facteur de dilution correspondant à la dilution réalisée pour la préparation de la suspension
mère (voir 9.2) ou pour la première dilution dénombrée;
c est le nombre de colonies dénombrées dans une seule boîte.
La moyenne pondérée des colonies dénombrées à partir de deux dilutions successives, x , est donnée par:
c
Σc
x =
c
()nn+ 0,1
12
où
Σc est la somme des colonies dénombrées dans toutes les boîtes retenues à partir de deux dilutions
successives;
n est le nombre de boîtes dénombré pour la suspension mère (ou pour la première dilution
1
dénombrée);
n est le nombre de boîtes dénombré pour la dilution 1:10 de la suspension mère (ou pour la deuxième
2
dilution dénombrée).
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Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs. Pour ce faire, si le dernier chiffre est inférieur à 5, le
chiffre précédent n'est pas modifié; si le dernier chiffre est égal ou supérieur à 5, le chiffre précédent est
augmenté d'une unité. Procéder ainsi par étapes jusqu'à obtenir deux chiffres significatifs. Noter le nombre, N,
obtenu.
11.2 Interprétation
11.2.1 Il convient de tenir compte de la variabilité inhérente du comptage sur gélose. Deux résultats pourront
être considérés comme différents seulement si leur différence ne dépasse pas 50 % ou, quand elle est
exprimée en log, seulement si elle dépasse 0,3 log.
Pour que le comptage soit précis, il convient de ne tenir compte que des géloses ou des membranes ayant
plus de 15 colonies et moins de 150 colonies. Vérifier que les compatges sont obtenus à partir de dilutions
validées selon la méthode sélectionnée (voir Article 12).
11.2.2 Lorsque le nombre d'UFC est supérieur à 15 et inférieur à 150 sur les géloses ou les membranes,
exprimer le résultat comme suit:
⎯ si S est au moins 1 g ou 1 ml, et V est au moins 1 ml, le nombre de levures et de moisissures par millilitre
ou par gramme d'échantillon est égal à N/S;
⎯ si S est inférieur à 1 g ou 1 ml, et/ou V est inférieur à 1 ml, le nombre de levures et de moisissures dans
l'échantillon (noter la quantité d'échantillon soumise à essai e
...
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