ISO 14853:2005
(Main)Plastics — Determination of the ultimate anaerobic biodegradation of plastic materials in an aqueous system — Method by measurement of biogas production
Plastics — Determination of the ultimate anaerobic biodegradation of plastic materials in an aqueous system — Method by measurement of biogas production
ISO 14853:2005 specifies a method for the determination of the ultimate anaerobic biodegradability of plastics by anaerobic microorganisms. The conditions described in the standard do not necessarily correspond to the optimum conditions for the maximum degree of biodegradation to occur. The test calls for exposure of the test material to sludge for a period of up to 60 days, which is longer than the normal sludge retention time (25 to 30 days) in anaerobic digesters, though digesters at industrial sites can have much longer retention times. The method applies to the following materials: natural and/or synthetic polymers, copolymers or mixtures thereof; plastic materials which contain additives such as plasticizers, colorants or other compounds; water-soluble polymers; materials which, under the test conditions, do not inhibit the microorganisms present in the inoculum.
Plastiques — Évaluation de la biodégradabilité anaérobie ultime des matériaux plastiques en milieu aqueux — Méthode par détermination de la production de biogaz
L'ISO 14853:2005 spécifie une méthode pour l'évaluation de la biodégradation anaérobie ultime des plastiques par des micro-organismes anaérobies. Les conditions décrites dans la présente Norme internationale ne correspondent pas nécessairement aux conditions optimales d'environnement permettant d'obtenir le niveau maximal de biodégradation. L'essai permet d'exposer le matériau d'essai à la boue pendant une période allant jusqu'à 60 jours, ce qui est plus long que la durée normale de conservation de la boue (25 à 30 jours) dans les digesteurs anaérobies, bien que les durées de rétention des digesteurs sur les sites industriels puissent être beaucoup plus longues. La méthode s'applique aux: polymères naturels et/ou synthétiques, copolymères ou mélange de cela, matériaux plastiques qui contiennent des additifs tels que plastifiants, colorants ou autres composes, polymères solubles dans l'eau, matériaux qui, dans les conditions d'essai, ne sont pas inhibiteurs pour les organismes présents dans l'inoculum.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14853
First edition
2005-02-01
Plastics — Determination of the ultimate
anaerobic biodegradation of plastic
materials in an aqueous system —
Method by measurement of biogas
production
Plastiques — Évaluation de la biodégradabilité anaérobie ultime des
matériaux plastiques en milieu aqueux — Méthode par détermination
de la production de biogaz
Reference number
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ISO 14853:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle . 3
5 Reagents and materials. 3
6 Apparatus. 6
7 Procedure. 6
8 Calculation and expression of results . 10
9 Validity of results . 12
10 Test report. 13
Annex A (informative) Example of apparatus for determining the amount of biogas produced
by measuring the increase in gas pressure. 14
Annex B (informative) Example of apparatus for determining volumetrically the amount of biogas
produced. 15
Annex C (informative) Example of a biodegradation curve . 17
Annex D (informative) Examples of data sheets for anaerobic biodegradability tests. 18
Annex E (informative) Table of water vapour pressures at various temperatures. 21
Annex F (informative) Calculation of theoretical carbon dioxide (ThCO ) and theoretical methane
2
(ThCH ) production. 22
4
Annex G (informative) Example of determination of recovery rate. 23
Annex H (informative) Example of a workflow scheme . 26
Bibliography . 28
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ISO 14853:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14853 was prepared by Technical Committee ISO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 5, Physical-
chemical properties.
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ISO 14853:2005(E)
Introduction
With the increasing use of plastics, their recovery and disposal have become a major issue. As a first priority,
recovery should be promoted. For example plastic litter, which originates mainly from consumers, is difficult to
recover completely. Additional examples of materials difficult to recover are found in the disposal of fishing
tackle, agricultural mulch films and water-soluble polymers. These plastic materials tend to leak from closed
waste management infrastructures into natural environments. Biodegradable plastics are now emerging as
one of the available options to solve such environmental issues. Plastic materials such as products or
packaging which are sent to anaerobic treatment facilities should be potentially biodegradable. Therefore it is
very important to determine the potential biodegradability of such materials and to obtain a quantitative
measure of their biodegradability in anaerobic environments.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14853:2005(E)
Plastics — Determination of the ultimate anaerobic
biodegradation of plastic materials in an aqueous system —
Method by measurement of biogas production
WARNING — Sewage and activated sludge may contain potentially pathogenic organisms. Therefore
appropriate precautions should be taken when handling them. Digesting sewage sludge produces
flammable gases which present fire and explosion risks. Care should be taken when transporting and
storing quantities of digesting sludge. Toxic test chemicals and those whose properties are not
known should be handled with care and in accordance with safety instructions. The pressure meter
and microsyringes should be handled carefully to avoid needle stick injuries. Contaminated syringe
needles should be disposed of in a safe manner.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the ultimate anaerobic biodegradability
of plastics by anaerobic microorganisms. The conditions described in this International Standard do not
necessarily correspond to the optimum conditions for the maximum degree of biodegradation to occur. The
test calls for exposure of the test material to sludge for a period of up to 60 days, which is longer than the
normal sludge retention time (25 to 30 days) in anaerobic digesters, though digesters at industrial sites can
have much longer retention times.
The method applies to the following materials:
Natural and/or synthetic polymers, copolymers or mixtures thereof;
Plastic materials which contain additives such as plasticizers, colorants or other compounds;
Water-soluble polymers;
Materials which, under the test conditions, do not inhibit the microorganisms present in the inoculum.
Inhibitory effects can be determined using an inhibition control or by another appropriate method (see e.g.
ISO 13641). If the test material is inhibitory to the inoculum, a lower test concentration, another inoculum
or a pre-exposed inoculum can be used.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 8245, Water quality — Guidelines for the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved
organic carbon (DOC)
ISO 13641 (all parts), Water quality — Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria
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ISO 14853:2005(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
ultimate anaerobic biodegradation
breakdown of an organic compound by microorganisms in the absence of oxygen to carbon dioxide, methane,
water and mineral salts of any other elements present (mineralization) plus new biomass
3.2
primary anaerobic biodegradation
structural change (transformation) of a chemical compound by microorganisms, resulting in the loss of a
specific property
3.3
digested sludge
mixture of settled sewage and activated sludge which have been incubated in an anaerobic digester at about
35 °C to reduce the biomass and odour and to improve the dewaterability of the sludge
NOTE Digested sludge contains an association of anaerobic fermentative and methanogenic bacteria producing
carbon dioxide and methane.
3.4
concentration of suspended solids in digested sludge
amount of solids obtained by filtration or centrifugation of a known volume of activated sludge and drying at
about 105 °C to constant mass
3.5
dissolved organic carbon
DOC
organic carbon in the water phase which cannot be removed by specified phase separation, for example by
–2
centrifugation at 40 000 m⋅s for 15 min or by membrane filtration using membranes with pores of 0,2 µm to
0,45 µm diameter
3.6
inorganic carbon
IC
inorganic carbon which is dissolved or dispersed in the aqueous phase of a liquid and is recoverable from the
supernatant liquid after the sludge has been allowed to settle
3.7
total dry solids
the amount of solids obtained by taking a known volume of test material or inoculum and drying at about
105 °C to constant mass
3.8
theoretical amount of evolved biogas
Thbiogas
maximum theoretical amount of biogas (CH + CO ) evolved after complete biodegradation of an organic
4 2
material under anaerobic conditions, calculated from the molecular formula and expressed as millilitres of
biogas evolved per milligram of test material under standard conditions
3.9
theoretical amount of evolved carbon dioxide
ThCO
2
maximum theoretical amount of carbon dioxide evolved after complete oxidation of an organic material,
calculated from the molecular formula and expressed as milligrams of carbon dioxide per milligram of test
material
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ISO 14853:2005(E)
3.10
theoretical amount of evolved methane
ThCH
4
maximum theoretical amount of methane evolved after complete reduction of an organic material, calculated
from the molecular formula and expressed as milligrams of methane evolved per milligram of test material
3.11
lag phase
lag period
time, measured in days, from the start of a test until adaptation and/or selection of the degrading
microorganisms is achieved and the degree of biodegradation of a chemical compound or organic matter has
increased to about 10 % of the maximum level of biodegradation
3.12
plateau phase
time, measured in days, from the end of the biodegradation phase until the end of the test
3.13
biodegradation phase
time, measured in days, from the end of the lag phase of a test until about 90 % of the maximum level of
biodegradation has been reached
3.14
maximum level of biodegradation
degree of biodegradation, measured in percent, of a chemical compound or organic matter in a test, above
which no further biodegradation takes place during the test
4 Principle
The biodegradability of a plastic material is determined using anaerobic conditions in an aqueous system.
Test material with a concentration of 20 mg/l to 200 mg/l organic carbon (OC) is incubated at (35 ± 2) °C in
sealed vessels together with digested sludge for a period normally not exceeding 60 days. Before use, the
digested sludge is washed so that it contains very low amounts of inorganic carbon (IC) and diluted to 1 g/l to
3 g/l total solids concentration. The increase in headspace pressure or the volumetric increase (depending on
the method used for measuring biogas evolution) in the test vessels resulting from the production of carbon
dioxide (CO ) and methane (CH ) is measured. A considerable amount of CO will be dissolved in water or
2 4 2
transformed to bicarbonate or carbonate under the conditions of the test. This inorganic carbon (IC) is
measured at the end of the test. The amount of microbiologically produced biogas carbon is calculated from
the net biogas production and the net IC formation in excess of blank values. The percentage biodegradation
is calculated from the total amount of carbon transformed to biogas and IC and the measured or calculated
amount of carbon added as test material. The course of biodegradation can be followed by making
intermediate measurements of biogas production. As additional information, the primary biodegradability can
be determined by specific analyses at the beginning and end of the test.
This test method is designed to determine the biodegradability of plastic materials under anaerobic conditions.
Optionally, the assessment of the recovery rate may also be of interest (see Annex G).
5 Reagents and materials
5.1 Distilled or deionized water, free of toxic substances, containing less than 2 mg/l of DOC.
5.2 Test medium, prepared using only reagents of recognized analytical grade.
Prepare the test medium to contain the following constituents in the stated amounts:
Anhydrous potassium dihydrogen phosphate KH PO 0,27 g
2 4
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ISO 14853:2005(E)
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate Na HPO ⋅12HO 1,12 g
2 4 2
Ammonium chloride NHCl 0,53 g
4
Calcium chloride dihydrate CaCl ⋅2HO 0,075 g
2 2
Magnesium chloride hexahydrate MgCl ⋅6HO 0,10 g
2 2
Iron(II) chloride tetrahydrate FeCl ⋅4HO 0,02 g
2 2
Resazurin (oxygen indicator) 0,001 g
Disodium sulfide (see note) Na S⋅9HO 0,1 g
2 2
Stock solution of trace elements (optional) 10 ml
Stock solutions of vitamins (optional) Vitamin solution No. 1 0,5 ml
Vitamin solution No. 2 0,5 ml
Add water (5.1) (oxygen-free) to 1 l
Adjust the pH of the medium with dilute mineral acid or alkali, if necessary, to 7 ± 0,2.
To ensure oxygen-free conditions, purge the water with nitrogen for about 20 min immediately before use.
Use freshly prepared sodium sulfide, or wash and dry it before use, to ensure sufficient reductive capacity. In
order to ensure strictly anaerobic conditions, it is recommended that a small amount of sodium dithionite be
added to the medium after it has been prepared until it becomes colourless. Do not use more than 10 mg/l,
because higher concentrations may produce inhibitory effects.
5.3 Trace-element solution (optional).
It is recommended that the test medium be supplemented with the following trace elements to improve the
anaerobic degradation process, especially if low inoculum concentrations are used:
Manganese chloride tetrahydrate MnCl ⋅4HO 0,05 g
2 2
Boric acid H BO 0,005 g
3 3
Zinc chloride ZnCl 0,005 g
2
Copper chloride CuCl 0,003 g
2
Disodium molybdate dihydrate Na MoO ⋅2HO 0,001 g
2 4 2
Cobalt chloride hexahydrate CoCl ⋅6HO 0,1 g
2 2
Nickel chloride hexahydrate NiCl ⋅6HO 0,01 g
2 2
Disodium selenite Na SeO 0,005 g
2 3
Disodium tungstate Na WO ⋅2HO 0,002 g
2 4 2
Add water (5.1) (oxygen free) to 1 l
Use 10 ml of trace-element solution per litre of test medium.
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5.4 Vitamin solutions (optional).
5.4.1 Vitamin solution No. 1
4-Aminobenzoic acid 40 mg
D-Biotin 10 mg
Dissolve in hot water (5.1) 500 ml
Allow to cool and add:
D-Pantothenic acid, calcium salt 50 mg
Pyridoxamine dihydrochloride 150 mg
Thiamine dichloride 100 mg
Filter the solution through a membrane filter (pore size 0,45 µm) that neither adsorbs nor releases organic
carbon in significant amounts, and store in the dark at 4 °C.
Use 0,5 ml of vitamin solution per litre of test medium.
5.4.2 Vitamin solution No. 2
Cyanocobalamin (vitamin B12) 10 mg
Dissolve in water (5.1) 100 ml
Filter the solution through a membrane filter (pore size 0,45 µm) that neither adsorbs nor releases organic
carbon in significant amounts, and store in the dark at 4 °C.
Use 0,5 ml of vitamin solution per litre of test medium.
5.5 Barrier solution.
NaCl 200 g
Dissolve in water (5.1) 1 000 ml
Acidify with citric acid 5 g
Add a pH-indicator such as bromophenol blue or methyl orange in order to be able to verify that the solution
remains acid during the test.
5.6 Test material.
The test material is usually added directly as solid to give a concentration of 20 mg/l to 200 mg/l organic
carbon. The test material (plastic) should be used in powdered form if possible.
The biodegradability of plastic materials which are not inhibitory to microorganisms can be determined using
concentrations higher than 200 mg/l organic carbon. In this case, ensure that the buffer capacity and mineral-
salt content of the medium are sufficient.
5.7 Reference material.
Use a well-defined anaerobically biodegradable polymer, e.g. poly-β-hydroxybutyrate, cellulose or
poly(ethylene glycol) 400 as a reference material. If possible, the form, size, solubility and concentration of the
reference material should be comparable to that of the test material.
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ISO 14853:2005(E)
Prepare the reference material in the same way as the test material.
5.8 Inhibition control (optional).
Add both the test material and the reference material to a vessel containing test medium (5.2) to give the
concentrations specified in 5.6 and 5.7, respectively.
6 Apparatus
6.1 Laboratory equipment
Required is usual laboratory equipment, plus the following:
6.1.1 Incubator or water or sand bath, thermostatically controlled at (35 ± 2) °C.
6.1.2 Carbon analyser, suitable for the direct determination of inorganic carbon in the range 1 mg/l to
200 mg/l IC.
6.2 Apparatus for use when biogas is measured by a manometric method
6.2.1 Pressure-resistant glass test vessels, nominal size 0,1 litre to 1 litre, each fitted with a gastight
septum capable of withstanding about 2 000 hPa (for an example, see Annex A). The headspace volume shall
be about 10 % to 30 % of the total volume. If gas is released at regular intervals, about 10 % headspace
volume is adequate, but if gas is released only at the end of the test, 30 % is more appropriate.
NOTE From a practical point of view, the use of serum bottles sealed with butyl rubber serum caps and crimped
aluminium rings is recommended.
6.2.2 Pressure-measuring device, e.g. a manometer connected to a suitable syringe needle, with a
gastight three-way valve to facilitate the release of excess pressure. Use and calibrate the device in
accordance with the manufacturer's instructions.
NOTE It is necessary to keep the internal volume of the tubing and the valve as low as possible so that errors
introduced by neglecting the volume of the device are not significant.
6.3 Apparatus for use when biogas is measured by a volumetric method
6.3.1 Glass test vessels (e.g. conical flasks or bottles), nominal size 0,1 litre to 1 litre, preferably 300 ml for
every 250 ml of medium. If foaming is not expected to occur, a headspace volume of 10 % to 20 % is
recommended. The vessels shall be equipped with a septum for gas sampling (see Annex B) and shall be
connected via gastight tubing to a graduated glass gas-collection tube which is filled with acidified salt solution
(barrier solution 5.5). This graduated glass tube shall be connected to an expansion tank which can be moved
up and down to bring the surface of the acidified solution in the expansion tank to the same level as that in the
gas-collection tube.
7 Procedure
7.1 General
Carry out the following initial operations using techniques which will ensure that the digested sludge comes
into contact with oxygen as little as practicable, e.g. work in a glove-box in an atmosphere of nitrogen or purge
the test vessels with nitrogen.
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7.2 Digested sludge
Collect digested sludge from a digester at a sewage treatment plant treating predominantly domestic sewage.
Be sure to collect active sludge. Use wide-necked bottles made of high-density polyethylene or a similar
material which can expand. Glass is not recommended for safety reasons. Fill the bottles to within 1 cm of the
top and seal. After transport to the laboratory, use directly or place in a laboratory-scale digester. Release
excess biogas.
Alternatively, use a laboratory-grown anaerobic sludge as a source of the inoculum.
Consider pre-incubation of the sludge to reduce background gas production and to decrease the influence of
the blanks. Allow the sludge to digest, without the addition of any nutrients or substrates, at (35 ± 2) °C for up
to 7 days.
It has been shown that pre-incubation for about 5 days gives an optimum decrease in gas production by the
blank without an unacceptable increase in either lag period or incubation period during the test. For test
materials which are expected to be poorly biodegradable, consider pre-incubating the sludge with the test
material to get a better adapted inoculum. In such a case, add test material with a concentration of 5 mg/l to
20 mg/l OC to the digested sludge. Wash the pre-incubated sludge carefully before use. Indicate in the test
report that pre-incubation was carried out.
7.3 Preparation of the inoculum
Wash the sludge just prior to use to reduce the IC content to less than 20 mg/l in the final test suspension. If
the IC has not been sufficiently lowered, wash the sludge an additional two times. Finally, suspend the sludge
in the requisite volume of test medium (5.2) and determine the concentration of total solids (see 3.7). The final
concentration of total solids in the test vessels shall be in the range 1 g/l to 3 g/l. Conduct the above
operations in such a way that the sludge has minimal contact with oxygen (e.g. use a nitrogen atmosphere).
7.4 Preparation of test suspensions and controls
At least three test vessels F shall be prepared for the test material, at least three for the blanks F and at
T B
least one vessel F for the positive control (reference material). One or more vessels F may optionally be
P I
prepared for each test material as an inhibition control (see Table 1). The same blanks and controls can be
used for several different test materials which are being tested together. Into all the vessels, introduce aliquots
of the diluted inoculum prepared in 7.3 so that the concentration of total solids is the same in all the vessels —
between 1 g/l and 3 g/l. Add the test material (5.6) and the reference material (5.7) to the appropriate vessels.
The OC concentration in the test suspensions shall normally be 100 mg/l. In the case of toxic test materials, it
may be reduced to 20 mg/l OC or even less if only the primary biodegradability is to be determined with
specific analyses.
NOTE Using lower test concentrations may result in a greater scatter of the test results.
In the case of the blank vessels, add equivalent amounts of oxygen-free water (5.1) instead of the test
material. An extra (replicate) test vessel containing test suspension may also be prepared for analyses,
carried out at the beginning of the test, to determine the pH and, if required, the total solids and IC.
Adjust the pH to 7 ± 0,2, if necessary, with small amounts of dilute mineral acid or alkali. Add the same
amount of neutralizing agent to all the test vessels. If the primary degradability is to be measured, take a
suitable sample from the extra test vessel and measure the test material concentration using a suitable
method. Place magnetic stirrer bars in the vessels if the test suspensions are to be stirred (optional). Ensure
that the total volume of liquid V and the volume of the headspace V are the same in all vessels (see 6.2.1).
L H
Note V and V (see Clause 8). If necessary, add additional oxygen-free test medium (5.2). Seal each vessel
L H
with a gastight septum and put them into the incubator (6.1.1).
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Table 1 — Scheme of test and control assays
Vessel Test material Reference material Inoculum
(biodegradable)
F Test + +
T1
F Test + +
T2
F Test + +
T3
F Blank +
B1
F Blank +
B2
F Blank +
B3
F Positive control + +
P
Extra replicate for analysis at
+ +
beginning of test
F Inhibition control (optional) + + +
I
7.5 Incubation and gas measurement
7.5.1 General
Incubation shall take place in sealed vessels at a constant temperature of (35 ± 2) °C, a normal temperature
for an anaerobic digester, in the absence of oxygen, initially in an atmosphere of pure nitrogen.
7.5.2 Gas measurement using a manometer (see Annex A)
Incubate the prepared vessels at (35 ± 2) °C for about 1 h to allow equilibration, and vent excess gas to the
atmosphere, for example by shaking each vessel in turn, inserting the needle of the manometer through the
seal and opening the valve until the manometer reads zero. If at this stage, or when making intermediate
measurements, the headspace pressure is less than atmospheric, introduce nitrogen gas to re-establish
atmospheric pressure. Close the valve and continue to incubate in the dark, ensuring that all parts of the
vessels are maintained at the incubation temperature.
Observe the vessels after incubation for 24 h to 48 h. Reject vessels if their contents show a distinct pink
coloration in the supernatant liquid. This is due to a change in colour of the resazurin, indicating the presence
of oxygen. While small amounts of oxygen can be tolerated in the system, higher concentrations can seriously
inhibit the course of anaerobic biodegradation.
Carefully mix the contents of each vessel by stirring or shaking for a few minutes at least two or three times
per week and before each pressure measurement. Measure the gas pressure, for example by inserting,
through the septum, the syringe needle connected to the manometer. Record the pressure in hectopascals.
Shaking resuspends the inoculum and ensures gas equilibrium. While measuring pressure, maintain the gas
in the headspace at the incubation temperature. Take care to prevent water entering the syringe needle.
Should this occur, dry the wetted parts and fit a new needle.
Either measure the gas pressure in the vessels weekly, venting excess gas to the atmosphere, or measure
the pressure only at the end of the test to detect the total amount of biogas produced. It is strongly
recommended, however, that intermediate readings of gas pressure be made, since the pressure increase
provides guidance as to when the test may be terminated and allows the kinetics to be followed.
7.5.3 Gas measurement using a volumetric device (see Annex
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14853
Première édition
2005-02-01
Plastiques — Évaluation de la
biodégradabilité anaérobie ultime des
matériaux plastiques en milieu aqueux —
Méthode par détermination de la
production de biogaz
Plastics — Determination of the ultimate anaerobic biodegradation of
plastic materials in an aqueous system — Method by measurement of
biogas production
Numéro de référence
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ISO 14853:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs . 4
6 Appareillage. 6
7 Mode opératoire . 7
8 Calcul et expression des résultats. 10
9 Validité des résultats . 13
10 Rapport d'essai . 13
Annexe A (informative) Exemple d'appareillage pour mesurer la production de biogaz à
l'aide d'une méthode manométrique en mesurant l'augmentation de la pression du gaz. 15
Annexe B (informative) Exemple d'appareillage pour mesurer la production de biogaz à l'aide
d'une méthode volumétrique en mesurant l'augmentation en volume. 16
Annexe C (informative) Exemple de courbe de biodégradation. 18
Annexe D (informative) Exemples de feuilles de données pour les essais de biodégradation
anaérobie . 19
Annexe E (informative) Tableau de la pression de vapeur d'eau à des températures variées. 22
Annexe F (informative) Calcul de la production de dioxyde de carbone théorique (THCO )
2
et de méthane (ThCH ) . 23
4
Annexe G (informative) Exemple de détermination d'un taux de récupération . 24
Annexe H (informative) Exemple de schéma de déroulement du travail. 28
Bibliographie . 30
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14853 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 61, Plastiques, sous-comité SC 5, Propriétés
physicochimiques.
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Introduction
Avec l'accroissement de l'utilisation des plastiques, leur récupération et leur mise au rebut sont devenues une
préoccupation majeure. Il convient de promouvoir la récupération comme première priorité. Il est par exemple
difficile de récupérer complètement les déchets plastiques qui proviennent principalement des
consommateurs. Des exemples additionnels de matériaux difficiles à récupérer sont trouvés dans la mise au
rebut des câbles de marine, des films de paillage agricole et des polymères hydrosolubles. Ces matériaux
plastiques ont tendance à échapper aux infrastructures fermées de gestion des déchets et se retrouvent dans
la nature. Les plastiques biodégradables sont maintenant en train d'émerger comme étant une des options
possibles pour résoudre de telles préoccupations environnementales. Il convient que les matériaux plastiques
tels que produits ou emballages dirigés vers des installations de traitement anaérobie soient potentiellement
biodégradables. Aussi, il est très important de déterminer le potentiel de biodégradabilité de tels matériaux et
d'obtenir une mesure quantitative de leur biodégradabilité dans des environnements anaérobies.
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NORME INTERNATIONALE ISO 14853:2005(F)
Plastiques — Évaluation de la biodégradabilité anaérobie ultime
des matériaux plastiques en milieu aqueux — Méthode par
détermination de la production de biogaz
AVERTISSEMENT — Les effluents et les boues d'eaux usées activées peuvent contenir des
organismes potentiellement pathogènes. Il convient donc de les manipuler avec les précautions
appropriées. La boue d'égout digérée produit des gaz inflammables qui présentent des risques
d'incendie et d'explosion. Il convient de faire attention lors du transport et du stockage de grandes
quantités de boue digérée. Il convient de manipuler avec précaution les produits chimiques à analyser
toxiques ou dont les propriétés ne sont pas connues, conformément aux instructions de sécurité. Il
convient de manipuler avec précaution le manomètre et les micro-seringues pour éviter les piqûres
d'aiguille. Il convient d'éliminer les aiguilles de seringue contaminées en toute sécurité.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour l'évaluation de la biodégradation anaérobie
ultime des plastiques par des micro-organismes anaérobies. Les conditions décrites dans la présente Norme
internationale ne correspondent pas nécessairement aux conditions optimales d'environnement permettant
d'obtenir le niveau maximal de biodégradation. L'essai permet d'exposer le matériau d'essai à la boue
pendant une période allant jusqu'à 60 jours, ce qui est plus long que la durée normale de conservation de la
boue (25 à 30 jours) dans les digesteurs anaérobies, bien que les durées de rétention des digesteurs sur les
sites industriels puissent être beaucoup plus longues.
La méthode s'applique aux:
polymères naturels et/ou synthétiques, copolymères ou mélange de cela;
matériaux plastiques qui contiennent des additifs tels que plastifiants, colorants ou autres composés;
polymères solubles dans l'eau;
matériaux qui, dans les conditions d'essai, ne sont pas inhibiteurs pour les organismes présents dans
l'inoculum. Les effets inhibiteurs peuvent être déterminés par un contrôle d'inhibition ou par une autre
méthode appropriée (voir par exemple l'ISO 13641). Si le matériau d'essai est un inhibiteur de l'inoculum,
une concentration d'essai plus faible, un autre inoculum, ou un inoculum préalablement exposé peuvent
être utilisés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 8245, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour le dosage du carbone organique total (COT) et du
carbone organique dissous (COD)
ISO 13641 (toutes les parties), Qualité de l'eau — Détermination de l'inhibition de la production de gaz des
bactéries anaréobies
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3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
biodégradation anaérobie ultime
décomposition d'un composé organique par des micro-organismes en l'absence d'oxygène, en dioxyde de
carbone, méthane, eau et sels minéraux de tous les autres éléments présents (minéralisation) et production
d'une nouvelle biomasse
3.2
biodégradation anaérobie primaire
changement structurel (transformation) d'un composé chimique par des micro-organismes, résultant dans la
perte d'une propriété spécifique
3.3
boue digérée
mélange des couches tassées de boues d'eaux usées et de boues activées, qui ont été incubées dans un
digesteur anaérobie à environ 35 °C pour réduire la biomasse et l'odeur et pour améliorer la capacité
d'assèchement de la boue
NOTE La boue digérée se compose d'une association de bactéries méthanogènes et fermentatives anaérobies
produisant du dioxyde de carbone et du méthane.
3.4
concentration de la boue digérée en matières solides en suspension
quantité de matières solides obtenue par filtration ou centrifugation d'un volume connu de boue activée et
séchage à environ 105 °C jusqu'à l'obtention d'un poids constant
3.5
carbone organique dissous
COD
carbone organique contenu dans la phase aqueuse qui ne peut pas être éliminée par une séparation de
−2
phase spécifique, telle qu'une centrifugation à 40 000 m·s pendant 15 min ou par une filtration sur
membrane au moyen de membranes ayant des pores de 0,2 µm à 0,45 µm de diamètre
3.6
carbone inorganique
CI
carbone inorganique qui est dissous ou dispersé dans la phase aqueuse d'un liquide et qui est récupérable
dans le surnageant après le tassage de la boue
3.7
matières solides sèches totales
quantité de matières solides obtenue en prenant un volume connu de matériau d'essai ou d'inoculum et en le
séchant à environ 105 °C jusqu'à l'obtention d'une masse constante
3.8
quantité théorique de biogaz produit
Thbiogaz
quantité théorique maximale de biogaz (CH + CO ) produit après biodégradation complète d'un matériau
4 2
organique dans des conditions anaérobies, calculée à partir de la formule moléculaire et exprimée en
millilitres de biogaz produit par milligramme de matériau d'essai dans des conditions normales
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3.9
quantité théorique de dioxyde de carbone produit
ThCO
2
quantité théorique maximale de dioxyde de carbone produite après oxydation complète d'un matériau
organique, calculée à partir de la formule moléculaire, et exprimée en milligrammes de dioxyde de carbone
par milligramme de matériau d'essai
3.10
quantité théorique de méthane produit
ThCH
4
quantité théorique maximale de méthane produit après réduction complète d'un matériau organique, calculée
à partir de la formule moléculaire, et exprimée en milligrammes de méthane produit par milligramme du
matériau d'essai
3.11
phase de latence
période de latence
durée écoulée, mesurée en jours, à partir du début de l'essai jusqu'à ce que l'adaptation et/ou la sélection des
micro-organismes soit atteinte et jusqu'à ce que le degré de biodégradation du composé chimique ou de la
matière organique ait atteint environ 10 % du niveau maximal de biodégradation
3.12
phase stationnaire
durée écoulée, mesurée en jours, entre la fin de la phase de biodégradation et la fin de l'essai
3.13
phase de biodégradation
durée écoulée, mesurée en jours, depuis la fin de la phase de latence de l'essai jusqu'à ce que l'on ait obtenu
environ 90 % du niveau maximal de biodégradation
3.14
niveau maximal de biodégradation
degré de biodégradation, mesuré en pour-cent, d'un composé chimique ou d'une matière organique lors d'un
essai, au-dessus duquel la biodégradation ne se poursuit pas
4 Principe
La détermination de la biodégradabilité d'un matériau plastique s'effectue en utilisant des conditions
anaérobies dans un système aqueux. Le matériau d'essai à une concentration de 20 mg/l à 200 mg/l de
carbone organique (CO) est incubé à (35 ± 2) °C dans des récipients étanches avec la boue digérée pendant
une période n'excédant pas 60 jours. La boue digérée est lavée, de façon à contenir de très faibles quantités
de carbone inorganique (CI), et diluée à une concentration totale de matières solides de 1 g/l à 3 g/l.
L'augmentation de la pression dans l'espace de tête ou l'augmentation volumétrique (suivant la méthode
utilisée pour mesurer l'évolution du biogaz) dans les récipients d'essai résultant de la production de dioxyde
de carbone (CO ) et de méthane (CH ) est mesurée. Une quantité importante de CO sera dissoute dans
2 4 2
l'eau ou transformée en bicarbonate ou en carbonate dans les conditions de l'essai. Ce carbone inorganique
est mesuré à la fin de l'essai. La quantité de carbone du biogaz produit microbiologiquement est calculée à
partir de la production nette de biogaz et la formation nette de CI en excès par rapport aux valeurs d'essai à
blanc. Le pourcentage de biodégradation est calculé à partir de la quantité totale de carbone transformé en
biogaz et en CI et de la quantité calculée ou mesurée de carbone ajouté comme matériau d'essai. Le
déroulement de la biodégradation peut être suivi en réalisant des mesurages intermédiaires de la production
de biogaz. La biodégradation primaire peut être déterminée, comme information supplémentaire, par des
analyses spécifiques au début et à la fin de l'essai.
La présente méthode d'essai est conçue pour déterminer la biodégradation des matériaux plastiques dans
des conditions anaérobies. Une estimation facultative d'un taux de récupération peut être intéressante (voir
l'Annexe G).
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5 Réactifs
5.1 Eau distillée ou déminéralisée, exempte de matières toxiques, contenant moins de 2 mg/l de COD.
5.2 Milieu d'essai, préparé exclusivement avec des réactifs de qualité pour analyse reconnue.
Préparer le milieu d'essai afin qu'il contienne les composants suivants aux quantités fixées.
Dihydrogénophosphate de potassium anhydre KH PO 0,27 g
2 4
Hydrogénophosphate de sodium dodécahydraté Na HPO , 12HO 1,12 g
2 4 2
Chlorure d'ammonium NHCl 0,53 g
4
Chlorure de calcium dihydraté CaCl , 2HO 0,075 g
2 2
Chlorure de magnésium hexahydraté MgCl , 6HO 0,10 g
2 2
Chlorure de fer tétrahydraté FeCl , 4HO 0,02 g
2 2
Résazurine (indicateur d'oxygène) 0,001 g
Sulfure de sodium nonahydraté Na S, 9HO 0,1 g
2 2
Solution contrôlée d'oligo-éléments (facultative) 10 ml
o
Solution contrôlée de vitamines (facultative) solution de vitamines n 1 0,5 ml
o
solution de vitamines n 2 0,5 ml
Ajouter de l‘eau (5.1) (sans oxygène) jusqu'à 1 l
Régler le pH du milieu avec un acide minéral ou une base, si nécessaire, à (7 ± 0,2).
Pour obtenir des conditions sans oxygène, purger l'eau par de l'azote pendant environ 20 min, juste avant
l'utilisation.
Utiliser du sulfure de sodium récemment produit ou le laver et le sécher avant utilisation pour assurer une
capacité de réduction suffisante. Afin d'obtenir les conditions anaérobies exactes après avoir préparé le milieu,
il est recommandé d'ajouter de petites quantités de dithionite de sodium jusqu'à ce que le milieu devienne
transparent. Plus de 10 mg/l ne sont pas recommandés, car de plus grandes concentrations peuvent
provoquer des effets inhibiteurs.
5.3 Solution d'oligo-éléments (facultative).
Il est recommandé d'ajouter au milieu d'essai les oligo-éléments suivants pour améliorer les processus de
dégradation anaérobie, en particulier si de faibles concentrations d'inoculum sont utilisées.
Chlorure de magnésium tétrahydraté MgCl , 4HO 0,05 g
2 2
Acide borique H BO 0,005 g
3 3
Chlorure de zinc ZnCl 0,005 g
2
Chlorure de cuivre CuCl 0,003 g
2
Molybdate de sodium dihydraté Na MoO , 2HO 0,001 g
2 4 2
Chlorure de cobalt hexahydraté CoCl , 6HO 0,1 g
2 2
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Chlorure de nickel hexahydraté NiCl , 6HO 0,01 g
2 2
Sélénite de sodium Na SeO 0,005 g
2 3
Tungstate de sodium Na WO , 2HO 0,002 g
2 4 2
Ajouter de l'eau (5.1) (sans oxygène) jusqu'à 1 l
Appliquer 10 ml/l de milieu.
5.4 Solutions de vitamines (facultative).
o
5.4.1 Solution de vitamines n 1
Acide 4-aminobenzoïque 40 mg
Biotine-D 10 mg
Dissoudre dans de l'eau chaude (5.1) 500 ml
Laisser refroidir et ajouter:
Acide pantothénique-D, sel de calcium 50 mg
Dihydrochlorure de pyridoxamine 150 mg
Dichlorure de thiamine 100 mg
Les solutions de vitamines sont filtrées sur des membranes (taille de pore 0,45 µm) qui n'absorbent ni ne
rejettent de carbone organique de façon significative puis sont stockées dans l'obscurité à 4 °C.
Appliquer 0,5 ml/l de milieu.
o
5.4.2 Solution de vitamines n 2
Cyanocobalamine (vitamine B12) 10 mg
Dissoudre dans l'eau déminéralisée (5.1) 100 ml
Les solutions de vitamines sont filtrées sur des membranes (taille de pore 0,45 µm) qui n'absorbent ni ne
rejettent de carbone organique de façon significative puis sont stockées dans l'obscurité à 4 °C.
Appliquer 0,5 ml/l de milieu.
5.5 Solution barrière.
Chlorure de sodium NaCl 200 g
Dissoudre dans de l'eau (5.1) 1 000 ml
Acidifier avec de l'acide citrique 5 g
Afin de vérifier l'acidification pendant l'essai, utiliser un indicateur de pH, par exemple le bleu de bromophénol
ou le méthylorange.
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5.6 Matériau d'essai.
Le matériau d'essai est généralement ajouté directement sous forme d'un solide pour donner une
concentration d'essai comprise entre 20 mg/l et 200 mg/l de carbone organique. Utiliser le matériau d'essai
(plastique) sous forme de poudre si possible.
La biodégradation des matériaux plastiques qui ne sont pas inhibiteurs des micro-organismes peut être
déterminée à l'aide de concentrations de carbone organique supérieures à 200 mg/l. Dans ce cas, s'assurer
que le pouvoir tampon et la teneur en sels minéraux du milieu sont suffisants.
5.7 Matériau de référence.
Un polymère biodégradable de manière bien définie par voie anaérobie par exemple du poly-β-
hydroxybutyrate, de la cellulose ou du poly(éthylène-glycol) 400 est utilisé comme matériau de référence. Il
convient, si possible, que la forme, la taille, la solubilité et la concentration du matériau de référence soient
comparables à celles du matériau d'essai utilisé.
Préparer le matériau de référence de la même manière que le matériau d'essai.
5.8 Contrôle d'inhibition (facultatif).
Ajouter le matériau d'essai et le matériau de référence dans un récipient contenant le milieu d'essai (5.2), pour
donner les concentrations spécifiées en 5.6 et 5.7 respectivement.
6 Appareillage
6.1 Matériel de laboratoire
Du matériel courant de laboratoire et le matériel suivant sont requis.
6.1.1 Incubateur ou bain d'eau ou de sable, contrôlé par thermostat (35 ± 2) °C.
6.1.2 Analyseur de carbone, approprié à la détermination directe du carbone inorganique sur une échelle
de 1 mg/l à 200 mg/l de CI.
6.2 Mesurage du biogaz à l'aide de méthodes manométriques
6.2.1 Récipients d'essai en verre résistant à la pression, d'une taille nominale comprise entre 0,1 l et 1 l,
tous équipés d'un septum étanche au gaz, pouvant résister à environ 2 000 hPa (exemple dans l'Annexe A).
Le volume de l'espace de tête doit représenter environ 10 % à 30 % du volume total. Si le biogaz est évacué
régulièrement, environ 10 % du volume de l'espace de tête conviennent mais si l'évacuation du gaz a lieu
seulement à la fin de l'essai, 30 % sont nécessaires.
NOTE D'un point de vue pratique, l'utilisation de fioles à sérum fermées hermétiquement par des bouchons de sérum
en caoutchouc butyle et des anneaux en aluminium sertis est recommandée.
6.2.2 Instrument de mesure de pression, par exemple manomètre raccordé à une aiguille de seringue
appropriée, un robinet étanche au gaz à trois voies facilite l'évacuation de la pression en excès. Utiliser et
calibrer le dispositif conformément aux instructions du fabricant.
NOTE Il est nécessaire de maintenir le volume interne du robinet et de la tuyauterie du transmetteur de pression
aussi bas que possible, afin que les erreurs introduites en négligeant le volume mort du matériel ne soient pas
significatives.
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6.3 Mesurage du biogaz à l'aide de méthodes volumétriques
6.3.1 Fioles d'essai en verre (par exemple fioles Erlenmeyer ou bouteilles), d'une taille nominale comprise
entre 0,1 l et 1 l, de préférence de 300 ml pour 250 ml de milieu; s'il n'y a pas de mousse, un volume de
l'espace de tête de 10 % à 20 % est recommandé) équipées d'un septum pour l'échantillonnage de gaz (voir
l'Annexe B), raccordées par une tuyauterie étanche au gaz au tube en verre collecteur de gaz, gradué et
rempli d'une solution de sel acidifée, la solution barrière (5.5). Ce tube en verre gradué est raccordé à un
réservoir d'expansion, qui peut être déplacé de haut en bas pour régler le niveau de la solution acidifiée du
réservoir d'expansion sur celle du dispositif de collecte du gaz.
7 Mode opératoire
7.1 Généralités
Réaliser les modes opératoires initiaux suivants à l'aide de techniques qui permettent de maintenir un contact
aussi faible que possible entre la boue digérée et l'oxygène, par exemple en travaillant avec une boîte à gants
dans une atmosphère d'azote ou en purgeant les bouteilles avec de l'azote.
7.2 Boue digérée
Collecter la boue digérée d'un digesteur dans une usine de traitement traitant des eaux usées principalement
domestiques. S'assurer de collecter la boue active. Utiliser les bouteilles à col large fabriquées à partir de
polyéthylène à haute densité ou d'un matériau similaire qui peut se dilater; le verre n'est pas recommandé
pour des raisons de sécurité. Remplir les bouteilles jusqu'à 1 cm du haut et les fermer hermétiquement. Après
le transport jusqu'au laboratoire, les utiliser directement ou les placer dans un digesteur à l'échelle du
laboratoire. Évacuer le biogaz en excès.
Une alternative consiste à utiliser de la boue anaérobie préparée au laboratoire comme source d'inoculum.
Prendre en considération la digestion préalable de la boue pour réduire la production de gaz résiduel et
diminuer l'influence des blancs. Laisser la boue digérer, sans ajouter d'éléments nutritifs ni de substrats, à
(35 ± 2) °C pendant une période allant jusqu'à 7 jours.
Il a été démontré que la digestion préalable pendant environ 5 jours donnait une baisse optimale de la
production de gaz de l'essai à blanc sans augmentation inacceptable de la période de latence ou d'incubation
pendant la phase d'essai. Pour les matériaux d'essai qui sont supposés être peu biodégradables, prendre en
considération l'exposition préalable de la boue avec le matériau d'essai pour obtenir un inoculum mieux
adapté. Dans un tel cas, il convient que le matériau d'essai soit ajouté à une concentration de 5 mg/l à 20 mg/l
de CO à la boue digérée, que la boue préalablement digérée soit lavée avec précaution avant utilisation et
que toute exposition préalable soit indiquée dans le rapport d'essai.
7.3 Préparation de l'inoculum
Laver la boue, juste avant de l'utiliser, pour réduire la teneur en CI à moins de 20 mg/l dans le mélange de
réaction d'essai final. Si la teneur en CI finale n'a pas été suffisamment réduite, relaver la boue une deuxième
fois. Finalement, maintenir la boue en suspension dans le volume nécessaire de milieu d'essai (5.2) et
déterminer la concentration des matières solides totales (3.7). La concentration finale des matières solides
totales dans les récipients d'essai doit être comprise dans la plage de 1 g/l à 3 g/l. Réaliser les opérations ci-
dessus de sorte que la boue ait un contact minimal avec l'oxygène (par exemple utiliser une atmosphère
d'azote).
7.4 Préparation de l'essai et épreuves de contrôle
Préparer les récipients d'essai F en trois exemplaires au moins pour le matériau d'essai et pour le blanc F
T B
et en un exemplaire au moins pour la substance de référence positive F . Préparer facultativement au moins
P
un récipient pour le contrôle d'inhibition F (voir Tableau 1). Les contrôles à blanc et les autres contrôles (voir
I
7.7) peuvent être utilisés pour plusieurs matériaux d'essai dans le même essai. Préparer l'inoculum dilué (7.3)
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avant de l'ajouter dans les récipients. Ajouter des aliquotes de l'inoculum afin que la concentration des
matières solides totales soit la même dans tous les récipients c'est-à-dire entre 1 g/l et 3 g/l. Ajouter le
matériau d'essai (5.6) et le matériau de référence (5.7). La concentration d'essai doit être normalement de
100 mg/l de CO. Dans le cas de matériaux d'essai toxiques, elle peut être réduite à 20 mg/l de CO ou même
moins si la biodégradation primaire seule avec des analyses spécifiques est à soumettre à essai.
NOTE Plus la concentration d'essai est faible, plus la dispersion des résultats d'essai peut être élevée.
Dans le cas des récipients contenant les blancs, ajouter les quantités équivalentes d'eau dépourvue
d'oxygène (5.1). Préparer un échantillon supplémentaire pour les analyses avec le matériau d'essai et
mesurer la valeur du pH et, si ces valeurs sont enregistrées, les matières solides et le CI.
Ajuster le pH à (7 ± 0,2) si nécessaire avec de petites quantités d'acide minéral dilué ou de petites quantités
de base. Ajouter la même quantité d'agents neutralisants à tous les récipients d'essai. Si la dégradation
primaire doit être mesurée, prélever un échantillon approprié du mélange d'essai supplémentaire et mesurer
la concentration du matériau d'essai à l'aide d'une analyse spécifique. Ajouter des agitateurs magnétiques
dans les r
...
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