ISO 21149:2006

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21149
First edition
2006-03-01


Cosmetics — Microbiology —
Enumeration and detection of aerobic
mesophilic bacteria
Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection des
bactéries aérobies mésophiles





Reference number
ISO 21149:2006(E)
©
ISO 2006

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ISO 21149:2006(E)
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ISO 21149:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
4.1 General. 2
4.2 Plate count. 2
4.3 Membrane filtration. 2
4.4 Detection of bacteria by enrichment. 3
5 Diluents, neutralizers and culture media. 3
5.1 General. 3
5.2 Neutralizing diluents and diluents . 3
5.3 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution). 4
5.4 Culture media . 4
6 Apparatus and glassware. 6
7 Strains of microorganisms . 7
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples . 7
9 Procedure. 7
9.1 General recommendation . 7
9.2 Preparation of the initial suspension. 7
9.3 Counting methods . 8
9.4 Enrichment. 9
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods). 9
11 Detection of growth (enrichment method) . 9
12 Expression of results. 10
12.1 Method of calculation for plate count. 10
12.2 Interpretation. 10
12.3 Examples. 11
12.4 Detection after enrichment . 13
13 Neutralization of the antimicrobial properties of the product. 13
13.1 General. 13
13.2 Preparation of inoculum . 14
13.3 Validation of counting methods. 14
13.4 Validation of the detection method by enrichment . 15
13.5 Interpretation of validation results. 15
14 Test report. 16
Annex A (informative) Other neutralizing diluents . 17
Annex B (informative) Other diluents. 19
Annex C (informative) Other culture media . 20
Annex D (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and rinsing liquids . 23
Bibliography . 24

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ISO 21149:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21149 was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21149:2006(E)

Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection
of aerobic mesophilic bacteria
1 Scope
This International Standard gives general guidelines for enumeration and detection of mesophilic aerobic
bacteria present in cosmetics,
⎯ by counting the colonies on agar medium after aerobic incubation, or
⎯ by checking the absence of bacterial growth after enrichment.
Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method may not be
appropriate for some products in every detail (e.g. certain water immiscible products). Other methods
(e.g. automated) may be substituted for the tests presented here provided that their equivalence has been
demonstrated or the method has been otherwise validated.
If needed, microorganisms enumerated or detected may be identified using suitable identification tests
described in the standards given in the Bibliography.
In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate
microbiological risk analysis, so as to determine the types of cosmetic products to which this International
Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological risk include those with low water
activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 21148:2005, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
aerobic mesophilic bacteria
mesophilic bacteria growing aerobically under the conditions specified in this International Standard
NOTE In the described conditions, other types of microorganisms (e.g. yeast, mould) can be detected.
3.2
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
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ISO 21149:2006(E)
3.3
sample
portion of the product (at least 1 g or 1 ml) which is used in the test to prepare the initial suspension
3.4
initial suspension
suspension (or solution) of a sample in a defined volume of an appropriate liquid (diluent, neutralizer, broth or
combination of them)
3.5
sample dilution
dilution of the initial suspension
4 Principle
4.1 General
This method involves enumeration of colonies on a non-selective agar medium or by the presence or absence
of bacterial growth after enrichment. The possible inhibition of microbial growth by the sample shall be
[1]
neutralized to allow the detection of viable microorganism . In all cases and whatever the methodology, the
[2] [3] [4]
neutralization of the antimicrobial properties of the product shall be checked and validated .
4.2 Plate count
Plate count consists of the following steps.
⎯ Preparation of poured plates or spread plates, using a specified culture medium, and inoculation of the
plates using a defined quantity of the initial suspension or dilution of the product.
⎯ Aerobic incubation of the plates at 32,5 °C ± 2,5 °C for 72 h ± 6 h.
⎯ Counting the number of colony forming units (CFU) and calculation of the number of aerobic mesophilic
bacteria per millilitre or per gram of product.
4.3 Membrane filtration
Membrane filtration consists of the following steps.
⎯ Transfer a suitable amount of the sample prepared as validated in the filtration apparatus wetted with a
small volume of an appropriate sterile diluent, filter immediately and wash according to the validated
procedure (see 13.3.4). Transfer the membrane filter onto the surface of the specified agar medium as
specified in ISO 21148.
⎯ Aerobic incubation of the membranes at 32,5 °C ± 2,5 °C for 72 h ± 6 h.
⎯ Counting the number of colony forming units (CFU) and calculation of the number of aerobic mesophilic
bacteria per millilitre or per gram of product.
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ISO 21149:2006(E)
4.4 Detection of bacteria by enrichment
Detection of bacteria by enrichment consists of the following steps:
⎯ Incubation at 32,5 °C ± 2,5 °C for at least 20 h of a defined quantity of the initial suspension in a
non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents.
⎯ Transfer of a defined quantity of the previous suspension on non-selective solid agar medium.
⎯ Aerobic incubation at 32,5 °C ± 2,5 °C for 48 h to 72 h.
⎯ Detection of growth and expression of results as “presence/absence” of aerobic mesophilic bacteria per
sample S of product.
5 Diluents, neutralizers and culture media
5.1 General
General specifications are given in ISO 21148. When water is used in a formula, use distilled water or purified
water as specified in ISO 21148.
The following diluents, neutralizers and culture media are suitable for enumeration and detection of aerobic
mesophilic bacteria. Other diluents, neutralizers and culture media may be used if they have been
demonstrated to be suitable for use.
5.2 Neutralizing diluents and diluents
5.2.1 General
The diluent is used to disperse the sample. It may contain neutralizers if the specimen to be tested has
antimicrobial properties. The efficacy of the neutralization shall be demonstrated before the determination of
the count (see Clause 13). Information relative to suitable neutralizers is given in Annex D.
5.2.2 Neutralizing diluents
5.2.2.1 Fluid casein digest – soy lecithin – polysorbate 20 medium (SCDLP 20 broth)
5.2.2.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 20,0 g
Soy lecithin 5,0 g
Polysorbate 20 40,0 ml
Water 960,0 ml
5.2.2.1.2 Preparation
Dissolve the polysorbate 20 in 960 ml of water by mixing while heating in a water bath at 49 °C ± 2 °C. Add
pancreatic digest of casein and soy lecithin. Heat for about 30 min to obtain solution. Mix and dispense the
medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall
be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
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5.2.2.2 Other neutralizing diluents
Other neutralizing diluents may be used as appropriate (see Annex A and Annex D).
5.2.3 Diluent
5.2.3.1 Fluid A
5.2.3.1.1 Composition
Peptic digest of animal tissue 1,0 g
Water 1 000 ml
5.2.3.1.2 Preparation
Dissolve 1 g of peptone in water to make 1 l. Heat with frequent agitation. Dispense into suitable containers.
Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,1 ± 0,2 when
measured at room temperature.
5.2.3.2 Other diluents
Other diluents may be used as appropriate (see Annex B).
5.3 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.3.1 Composition
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water 1 000 ml
5.3.2 Preparation
Dissolve the components in the water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize in
the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured
at room temperature.
5.4 Culture media
5.4.1 General
Culture media may be prepared as follows, or from dehydrated culture media according to the instructions of
the manufacturer. Ready-to-use media may be used when their composition and/or growth yields are
comparable to those of the formulas given herein.
5.4.2 Culture media for counting
5.4.2.1 Soybean–casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)
5.4.2.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
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Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.2.1.2 Preparation
Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating. Dispense
the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization and
cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.4.2.2 Other media for counting
Other media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.3 Culture media for detection
5.4.3.1 General
When chosen, an enrichment broth and an agar medium shall be used for bacterial detection.
The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It may
contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties.
5.4.3.2 Enrichment broth: Eugon LT 100 broth
5.4.3.2.1 General
This medium contains ingredients
⎯ which neutralize inhibitory substances present in the sample: lecithin and polysorbate 80,
⎯ dispersing agent: octoxynol 9.
5.4.3.2.2 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Sodium chloride 4,0 g
Sodium sulfite 0,2 g
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Water 1 000 ml
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5.4.3.2.3 Preparation
Dissolve successively polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin into boiling water until their complete
dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Dispense the medium into suitable
containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization, the pH shall be equivalent to
7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.4.3.3 Agar media for detection
5.4.3.3.1 Eugon LT 100 agar medium
5.4.3.3.1.1 Composition
Pancreatic digest of casein 15,0 g
Papaic digest of soybean meal 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Sodium chloride 4,0 g
Sodium sulfite 0,2 g
Glucose 5,5 g
Egg lecithin 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
5.4.3.3.1.2 Preparation
Dissolve successively polysorbate 80, octoxynol 9 and egg lecithin into boiling water until their complete
dissolution. Dissolve the other components by mixing while heating. Mix gently to avoid foam. Dispense the
medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min. After sterilization and cooling
down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room temperature.
5.4.3.3.2 Other agar media for detection
Other media may be used as appropriate (see Annex C).
5.4.4 Agar medium for cultivation of reference strains
Use soybean-casein digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA) (5.4.2.1).
6 Apparatus and glassware
The laboratory equipment, apparatus and glassware are described in ISO 21148.
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ISO 21149:2006(E)
7 Strains of microorganisms
For testing the efficacy of neutralizers, two strains representative of both Gram negative and Gram positive
[2] [5]
microorganisms , respectively, are used:
⎯ Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (equivalent strain: CIP 82.118 or NCIMB 8626 or NBRC 13275 or
KCTC 2513 or other equivalent national collection strain);
1) 2) 3) 4)
⎯ Staphylococcus aureus ATCC 6538 (equivalent strain: CIP 4.83 or NCIMB 9518 or NBRC 13276 or
5)
KCTC 1916 or other equivalent national collection strain).
An alternative to the Gram negative strain may be: Escherichia coli ATCC 8739 (equivalent strain: CIP 53.126
or NCIMB 8545 or NBRC 3972 or KCTC 2571 or other equivalent national collection strain).
The culture should be reconstituted according to the procedures provided by the supplier of reference strain.
The strains may be kept in the laboratory according to the EN 12353.
8 Handling of cosmetic products and laboratory samples
If necessary store products to be tested at room temperature. Do not incubate, refrigerate or freeze products
(3.2) and samples (3.3) before or after analysis.
Sampling of cosmetic products to be analysed should be carried out, as described in ISO 21148. Analyse
samples as specified in ISO 21148 and in accordance with the following procedure.
9 Procedure
9.1 General recommendation
Use sterile material, equipment and aseptic techniques to prepare the sample, initial suspension and dilutions.
In the case of the preparation of an initial suspension, the time which elapses between the end of the
preparation and the moment the inoculum comes into contact with the culture medium shall not exceed 45 min,
unless specifically mentioned in the established protocols or documents.
9.2 Preparation of the initial suspension
9.2.1 General
The initial suspension is prepared from a sample (3.3) of at least 1 g or 1 ml of the well-mixed product (3.2)
under test.
Note S the exact mass or volume of the sample.
The initial suspension is usually 1:10 dilution. Larger volumes of diluent or enrichment broth may be required if
high levels of contamination are expected and/or if anti-microbial properties are still present in 1:10 dilution.

1) ATCC = American Type Culture Collection.
2) CIP = Institut Pasteur Collection.
3) NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria.
4) NBRC = National Biological Resource Center.
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture.
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ISO 21149:2006(E)
9.2.2 Water-miscible products
Transfer the sample S of product to an appropriate volume (e.g. 9 ml) of neutralizing diluent (5.2.2) or diluent
(5.2.3) or enrichment broth (5.4.3.2), depending on the method used (9.3 or 9.4).
Note the dilution factor d.
9.2.3 Water-immiscible products
Transfer the sample (S) of product to a suitable container containing a suitable quantity of solubilizing agent
(e.g. polysorbate 80). Disperse the sample within the solubilizing agent and add an appropriate volume (e.g.
9 ml) of neutralizing diluent (5.2.2) or diluent (5.2.3) or enrichment broth (5.4.3.2), depending on the method
used (9.3 or 9.4).
Note the dilution factor d.
9.3 Counting methods
9.3.1 Dilutions for counting methods
Usually, the initial suspension is the first counted dilution. If needed, additional serial dilutions (e.g. 1:10
dilution) may be performed from the initial suspension using the same diluent (according to the expected level
of contamination of the product).
Generally counting is performed using at least two Petri dishes. But it is possible to use only one Petri dish in
case of routine testing, or if counts are performed on successive dilutions of the same sample or according to
previous results.
9.3.2 Plate-count methods
9.3.2.1 Pour-plate method
In Petri dishes 85 mm to 100 mm in diameter, add 1 ml of the initial suspension and/or sample dilution
prepared as validated (see Clause 13) and pour 15 ml to 20 ml of the melted agar medium (5.4.2) kept in a
water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the amount of agar medium is increased
accordingly.
Mix the initial suspension and/or sample dilution with the medium carefully rotating or tilting the plates
sufficiently to disperse them. Allow the mixture in the Petri dishes to solidify on a horizontal surface at room
temperature.
9.3.2.2 Surface spread method
In Petri dishes 85 mm to 100 mm in diameter, put 15 ml to 20 ml of the melted agar medium (5.4.2) kept in a
water bath at no more than 48 °C. If larger Petri dishes are used, the volume of the agar is increased
accordingly. Allow plates to cool and solidify, for example in a microbiological cabinet or in an incubator.
Spread over the surface of the medium a measured volume of not less than 0,1 ml of the initial suspension
and/or sample dilution prepared as validated (see Clause 13).
9.3.2.3 Membrane filtration method
Use membranes having a nominal pore size no greater than 0,45 µm.
Transfer a suitable amount of the initial suspension or of the sample dilution prepared as validated (preferably
representing at least 1 g or 1 ml of the product) onto the membrane. Filter immediately and wash the
membrane (follow the procedure developed during the validation, see Clause 13).
Transfer the membrane onto the surface of the agar medium (5.4.2).
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ISO 21149:2006(E)
9.3.2.4 Incubation
Unless otherwise stated, invert the inoculated dishes and place them in the incubator set at 32,5 °C ± 2,5 °C
for 72 h ± 6 h. After incubation, the dishes shall, if possible, be examined immediately. Otherwise, they may
be stored, unless otherwise specified, for up to a maximum of 24 h in the refrigerator.
NOTE In certain cases, where there is a potential for confusing particles from the product with counted colonies, it
can be useful to prepare duplicate dishes containing the same sample dilutions and agar medium which are stored in the
refrigerator for comparison with incubated dishes.
9.4 Enrichment
9.4.1 General
The initial suspension is prepared (see 9.2) in the enrichment broth (5.4.3.2) chosen following the procedure
developed during the validation (see Clause 13).
9.4.2 Incubation of the sample
9.4.2.1 General
Incubate the initial suspension prepared in broth (5.4.3.2) at 32,5 °C ± 2,5 °C for at least 20 h.
9.4.2.2 Subculture
Using a sterile pipette, transfer 0,1 ml to 0,5 ml of the incubated suspension on the surface of a Petri dish
(diameter 85 mm to 100 mm) containing approximately 15 ml to 20 ml of suitable detection agar medium
(5.4.2.1). If larger Petri dishes are used, the volume of the agar is increased accordingly.
9.4.2.3 Incubation of the subculture
Do not invert the inoculated plate (or wait for the absorption of the incubated suspension by the agar before
inverting) and incubate at 32,5 °C ± 2,5 °C for 48 h to 72 h.
10 Counting of colonies (plate counts and membrane filtration methods)
After incubation, count the colonies:
⎯ in Petri dishes containing 30 colonies to 300 colonies; if less than 30 colonies are counted, see 12.2.3;
⎯ on membranes containing 15 colonies to 150 colonies; if less than 15 colonies are counted, see 12.2.3.
11 Detection of growth (enrichment method)
After incubation of the subculture, check the agar surface and record the presence or absence of growth.
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ISO 21149:2006(E)
12 Expression of results
12.1 Method of calculation for plate count
Calculate the number N of microorganisms present in the sample S, using:
⎯ m, the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates in Equation (1)
⎯ c, the number of colonies counted on a single plate in Equation (2), or
⎯ x , the weighted mean of the counts obtained from two successive dilutions in Equation (3),
c
according to the following equations:
N = m/(V × d ) (1)
N = c/(V × d ) (2)
N = x /(V × d ) (3)
c
where
m is the arithmetic mean of the counts obtained from the duplicates;
V is the volume of inoculum applied to each dish, in millilitre;
d is the dilution factor corresponding to the dilution made for the preparation of the initial suspension
(9.2) or for the first counted dilution;
c is the number of colonies counted on a single plate;
x is the weighted mean of the colonies counted from two successive dilutions and is calculated as
c
follows:
c
∑
x =
c
nn+ 0,1
12
where
c is the sum of colonies counted on all the dishes retained from two successive dilutions;
∑
n is the number of dishes counted for the initial suspension (or for the first counted dilution);
1
n is the number of dishes counted for the 1/10 dilution of the initial suspension (or for the
2
second counted dilution).
Round off the result calculated to two significant figures. For this, if the last figure is below 5, the preceding
figure is not modified; if the last figure is 5 or more, the preceding figure is increased by one unit. Proceed
stepwise until two significant figures are obtained. Note the number N obtained.
12.2 Interpretation
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21149
Première édition
2006-03-01


Cosmétiques — Microbiologie —
Dénombrement et détection des bactéries
aérobies mésophiles
Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic
mesophilic bacteria





Numéro de référence
ISO 21149:2006(F)
©
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principes. 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri . 2
4.3 Filtration sur membrane. 2
4.4 Détection des bactéries par enrichissement . 3
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture. 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Diluants neutralisants et diluants . 3
5.3 Diluant pour la suspension bactérienne (solution tryptone chlorure de sodium). 4
5.4 Milieux de culture. 4
6 Matériel et verrerie. 7
7 Souches de micro-organismes . 7
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire . 7
9 Mode opératoire . 8
9.1 Recommandations générales. 8
9.2 Préparation de la suspension mère. 8
9.3 Méthodes de dénombrement. 8
9.4 Enrichissement . 9
10 Dénombrement des colonies (méthodes de dénombrement sur gélose et par filtration sur
membrane). 10
11 Détection de croissance (méthode par enrichissement). 10
12 Expression des résultats . 10
12.1 Méthode de calcul pour le dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri . 10
12.2 Interprétation. 11
12.3 Exemples . 12
12.4 Détection après enrichissement . 14
13 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit . 14
13.1 Généralités . 14
13.2 Préparation de l'inoculum. 14
13.3 Validation des méthodes de dénombrement . 14
13.4 Validation de la méthode de détection par enrichissement. 16
13.5 Interprétation des résultats de validation . 16
14 Rapport d'essai . 17
Annexe A (informative) Autres diluants neutralisants . 18
Annexe B (informative) Autres diluants. 20
Annexe C (informative) Autres milieux de culture . 21
Annexe D (informative) Neutralisants de l'activité antimicrobienne des conservateurs et des
liquides de rinçage . 25
Bibliographie . 26
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO 21149:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21149 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.

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NORME INTERNATIONALE ISO 21149:2006(F)

Cosmétiques — Microbiologie — Dénombrement et détection
des bactéries aérobies mésophiles
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour le dénombrement et la
détection des bactéries aérobies mésophiles présentes dans les cosmétiques,
⎯ par dénombrement des colonies en milieu gélosé après une incubation aérobie, ou
⎯ en vérifiant l'absence de croissance bactérienne après enrichissement.
En raison de la grande variété de produits cosmétiques entrant dans ce domaine d'application, la présente
méthode peut ne pas être, en tout point, adaptée à certains produits (par exemple à certains produits non
miscibles dans l'eau). Il est possible de remplacer les essais présentés ici par d'autres méthodes
(automatisées, par exemple), sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été
validée par ailleurs.
Au besoin, les micro-organismes dénombrés ou détectés peuvent être identifiés à l'aide d'essais
d'identification appropriés, décrits dans les normes indiquées en Bibliographie.
Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse
de risque microbiologique appropriée, afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de la
présente Norme internationale. Les produits dont on considère qu'ils présentent un faible risque
microbiologique comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydro-alcooliques, les
produits ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
bactéries aérobies mésophiles
bactéries mésophiles se développant en aérobie dans les conditions spécifiées dans la présente Norme
internationale
NOTE D'autres types de micro-organismes (par exemple des levures et des moisissures) peuvent également être
détectés dans les conditions décrites.
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ISO 21149:2006(F)
3.2
produit
portion d'un produit cosmétique identifié, reçue au laboratoire pour essais
3.3
échantillon
portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée dans l'essai pour préparer la suspension mère
3.4
suspension mère
suspension (ou solution) d'un échantillon dans un volume défini d'un liquide approprié (diluant, agent
neutralisant, bouillon ou combinaison de ceux-ci)
3.5
dilution(s) de l'échantillon
dilution(s) de la suspension mère
4 Principes
4.1 Généralités
Cette méthode est fondée sur le dénombrement de colonies sur un milieu gélosé non sélectif ou sur la
présence ou l'absence de croissance bactérienne après enrichissement. L'inhibition potentielle de la
croissance bactérienne par l'échantillon doit être neutralisée pour permettre la détection des
[1]
micro-organismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthode employée, la neutralisation des
[2] [3] [4]
propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et validée .
4.2 Dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri
Le dénombrement sur gélose comprend les étapes suivantes.
⎯ Préparation des géloses pour ensemencement en profondeur ou pour étalement en surface, au moyen
d'un milieu de culture défini, et inoculation des géloses avec une quantité définie de la suspension mère
ou d'une dilution du produit.
⎯ Incubation aérobie des géloses à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 72 h ± 6 h.
⎯ Dénombrement du nombre d'unités formant colonies (UFC) et calcul du nombre de bactéries aérobies
mésophiles par millilitre ou par gramme de produit.
4.3 Filtration sur membrane
La filtration sur membrane comprend les étapes suivantes.
⎯ Transfert d'une quantité adaptée d'échantillon préparé selon une méthode validée dans l'appareil de
filtration humidifié à l'aide d'un faible volume de diluant approprié stérile, filtration immédiate et lavage
selon un mode opératoire validé (voir 13.3.4). Transfert de la membrane de filtration à la surface du
milieu gélosé spécifié, comme indiqué dans l'ISO 21148.
⎯ Incubation aérobie des membranes à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 72 h ± 6 h.
⎯ Dénombrement du nombre d'unités formant colonies (UFC) et calcul du nombre de bactéries aérobies
mésophiles par millilitre ou par gramme de produit.
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ISO 21149:2006(F)
4.4 Détection des bactéries par enrichissement
La détection des bactéries par enrichissement comprend les étapes suivantes.
⎯ Incubation à 32,5 °C ± 2,5 °C, pendant au moins 20 h, d'une quantité définie de la suspension mère dans
un milieu liquide non sélectif contenant des agents neutralisants et/ou des agents de dispersion
appropriés.
⎯ Transfert d'une quantité définie de la suspension précédente sur un milieu gélosé solide non sélectif.
⎯ Incubation aérobie à 32,5 °C ± 2,5 °C pendant 48 h à 72 h.
⎯ Détection de la croissance et expression des résultats sous la forme de «présence/absence» de
bactéries aérobies mésophiles par échantillon S du produit.
5 Diluants, agents neutralisants et milieux de culture
5.1 Généralités
Les spécifications générales sont indiquées dans l'ISO 21148. Lorsque de l'eau est mentionnée dans une
formulation, utiliser de l'eau distillée ou purifiée telle qu'indiquée dans l'ISO 21148.
Les diluants, agents neutralisants et milieux de culture suivants conviennent pour le dénombrement et la
détection de bactéries aérobies mésophiles. D'autres diluants, agents neutralisants et milieux de culture
peuvent être utilisés s'il a été démontré qu'ils sont adaptés pour cet emploi.
5.2 Diluants neutralisants et diluants
5.2.1 Généralités
Le diluant est utilisé pour disperser l'échantillon. Il peut contenir des agents neutralisants si l'échantillon à
soumettre à essai possède des propriétés antimicrobiennes. L'efficacité de la neutralisation doit être
démontrée avant la détermination de la concentration microbienne (voir Article 13). Des informations relatives
à des agents neutralisants appropriés sont fournies dans l'Annexe D.
5.2.2 Diluants neutralisants
5.2.2.1 Milieu à la peptone de caséine-lécithine de soja-polysorbate 20 (bouillon SCDLP 20)
5.2.2.1.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 20,0 g
Lécithine de soja 5,0 g
Polysorbate 20 40,0 ml
Eau 960,0 ml
5.2.2.1.2 Préparation
Dissoudre le polysorbate 20 dans 960 ml d'eau en mélangeant tout en chauffant dans un bain-marie à
49 °C ± 2 °C. Ajouter la peptone pancréatique de caséine et la lécithine de soja. Chauffer pendant environ
30 min afin d'obtenir une solution. Mélanger et répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à
l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, la mesure étant effectuée
à la température ambiante.
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ISO 21149:2006(F)
5.2.2.2 Autres diluants neutralisants
D'autres diluants neutralisants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe A et Annexe D).
5.2.3 Diluant
5.2.3.1 Liquide A
5.2.3.1.1 Composition
Peptone pepsique de tissus animaux 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.2.3.1.2 Préparation
Dissoudre 1 g de peptone dans l'eau pour obtenir 1 l. Chauffer en agitant fréquemment. Répartir dans des
récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de
7,1 ± 0,2, la mesure étant effectuée à la température ambiante.
5.2.3.2 Autres diluants
D'autres diluants peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe B).
5.3 Diluant pour la suspension bactérienne (solution tryptone chlorure de sodium)
5.3.1 Composition
Tryptone, peptone pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients
appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, la
mesure étant effectuée à la température ambiante.
5.4 Milieux de culture
5.4.1 Généralités
Les milieux de culture peuvent être préparés comme suit ou à partir de milieux de culture déshydratés en
respectant les instructions du fabricant. Des milieux prêts à l'emploi peuvent être utilisés si leur composition
et/ou leur rendement de croissance sont comparables à ceux des formulations indiquées ci-après.
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ISO 21149:2006(F)
5.4.2 Milieux de culture pour le dénombrement
5.4.2.1 Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (SCDA) ou gélose trypto-caséine soja
(TSA)
5.4.2.1.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.2.1.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l'eau en mélangeant tout en chauffant.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après
stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, la mesure étant effectuée à la température
ambiante.
5.4.2.2 Autres milieux pour le dénombrement
D'autres milieux peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe C).
5.4.3 Milieux de culture pour la détection par enrichissement
5.4.3.1 Généralités
Un bouillon d'enrichissement et un milieu gélosé doivent être utilisés pour la détection de bactéries, lorsque
cette méthode est sélectionnée.
Le bouillon d'enrichissement sert à disperser l'échantillon et à accroître la population microbienne initiale. Il
peut contenir des agents neutralisants si l'échantillon à soumettre à essai possède des propriétés
antimicrobiennes.
5.4.3.2 Bouillon d'enrichissement: bouillon Eugon LT 100
5.4.3.2.1 Généralités
Ce milieu contient
⎯ des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans l'échantillon: lécithine et
polysorbate 80, et
⎯ un agent dispersant: octoxynol 9.
5.4.3.2.2 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
L-cystine 0,7 g
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Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d'œuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.3.2.3 Préparation
Dissoudre successivement dans l'eau bouillante le polysorbate 80, l'octoxynol 9 et la lécithine d'œuf jusqu'à
dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant. Répartir le milieu
dans des récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation, le pH doit
être de 7,0 ± 0,2, la mesure étant effectuée à la température ambiante.
5.4.3.3 Milieux gélosés pour la détection par enrichissement
5.4.3.3.1 Milieu gélosé Eugon LT 100
5.4.3.3.1.1 Composition
Peptone pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone papaïque de soja 5,0 g
L-cystine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d'œuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Octoxynol 9 1,0 g
Gélose 15,0 g
Eau 1 000 ml
5.4.3.3.1.2 Préparation
Dissoudre successivement dans l'eau bouillante le polysorbate 80, l'octoxynol 9 et la lécithine d'œuf jusqu'à
dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant. Mélanger
doucement pour éviter toute formation de mousse. Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser
à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min. Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, la
mesure étant effectuée à la température ambiante.
6 © ISO 2006 – Tous droits réservés

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ISO 21149:2006(F)
5.4.3.3.2 Autres milieux gélosés pour la détection par enrichissement
D'autres milieux peuvent être utilisés s'ils sont appropriés (voir Annexe C).
5.4.4 Milieu gélosé pour la culture de souches de référence
Utiliser le milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja (SCDA) ou la gélose trypto-caséine soja (TSA)
(5.4.2.1).
6 Matériel et verrerie
Les équipements, le matériel et la verrerie de laboratoire sont décrits dans l'ISO 21148.
7 Souches de micro-organismes
Afin de vérifier l'efficacité des agents neutralisants, deux souches représentatives aussi bien des
[2] [5]
micro-organismes Gram négatifs que Gram positifs , respectivement, sont utilisées:
⎯ Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (souche équivalente: CIP 82.118 ou NCIMB 8626 ou
NBRC 13275 ou KCTC 2513, ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale);
1) 2) 3) 4)
⎯ Staphylococcus aureus ATCC 6538 (souche équivalente: CIP 4.83 ou NCIMB 9518 ou NBRC 13276
5)
ou KCTC 1916, ou toute autre souche équivalente issue d'une collection nationale).
Une alternative à la souche Gram négative peut être: Escherichia coli ATCC 8739 (souche équivalente:
CIP 53.126 ou NCIMB 8545 ou NBRC 3972 ou KCTC 2571, ou toute autre souche équivalente issue d'une
collection nationale).
Il convient de reconstituer la culture conformément aux méthodes indiquées par le fournisseur de la souche
de référence.
Les souches peuvent être conservées au laboratoire conformément à l'EN 12353.
8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire
Si nécessaire, conserver les produits à soumettre à essai à température ambiante. Ne pas incuber, réfrigérer
ou congeler les produits (3.2) et les échantillons (3.3) avant ou après analyse.
Il convient d'effectuer l'échantillonnage des produits cosmétiques à analyser, tel que décrit dans l'ISO 21148.
Analyser les échantillons selon l'ISO 21148 et selon le mode opératoire suivant.

1) ATCC = American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types).
2) CIP = Collection de l'Institut Pasteur.
3) NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Collection nationale de bactéries industrielles et
marines).
4) NBRC = National Biological Resource Center (Centre de national de ressources biologiques).
5) KCTC = Korean Collection for Type Culture (Collection coréenne de cultures types).
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ISO 21149:2006(F)
9 Mode opératoire
9.1 Recommandations générales
Utiliser du matériel et des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques pour préparer
l'échantillon, la suspension mère et les dilutions. En cas de préparation d'une suspension mère, le temps
écoulé entre la fin de la préparation et le moment où l'inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne
doit pas dépasser 45 min, sauf indications particulières mentionnées dans les protocoles ou dans la
documentation préétablis.
9.2 Préparation de la suspension mère
9.2.1 Généralités
La suspension mère est préparée à partir d'un échantillon (3.3) d'au moins 1 g ou 1 ml du produit à analyser
(3.2) préalablement mélangé avec soin.
Noter S comme le volume ou la masse exact(e) de l'échantillon.
La suspension mère est généralement une dilution 1:10. De plus grands volumes de diluant ou de bouillon
d'enrichissement peuvent être nécessaires si des niveaux élevés de contamination sont attendus et/ou si des
propriétés antimicrobiennes persistent dans la dilution 1:10.
9.2.2 Produits miscibles dans l'eau
Transférer l'échantillon S de produit dans un volume adéquat (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (5.2.2)
ou de diluant (5.2.3) ou de bouillon d'enrichissement (5.4.3.2), selon la méthode utilisée (9.3 ou 9.4).
Noter d le facteur de dilution.
9.2.3 Produits non miscibles dans l'eau
Transférer l'échantillon S de produit dans un récipient approprié contenant une quantité adéquate d'agent
solubilisant (polysorbate 80, par exemple). Disperser l'échantillon dans l'agent solubilisant et ajouter un
volume approprié (par exemple 9 ml) de diluant neutralisant (5.2.2) ou de diluant (5.2.3) ou de bouillon
d'enrichissement (5.4.3.2), selon la méthode utilisée (9.3 ou 9.4).
Noter «d» le facteur de dilution.
9.3 Méthodes de dénombrement
9.3.1 Dilutions pour les méthodes de dénombrement
La suspension mère est généralement la première dilution dénombrée. Au besoin, d'autres dilutions en série
(dilution 1:10, par exemple) peuvent être réalisées à partir de la suspension mère en utilisant le même diluant
(en fonction du niveau de contamination attendu pour le produit).
Le dénombrement est généralement effectué en utilisant au moins deux boîtes de Pétri. Cependant, il est
possible de n'utiliser qu'une seule boîte de Pétri dans le cas d'un essai de routine ou si les dénombrements
sont réalisés sur des dilutions successives du même échantillon ou en fonction de résultats antérieurs.
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ISO 21149:2006(F)
9.3.2 Méthodes de dénombrement sur gélose en boîtes de Pétri
9.3.2.1 Méthode par ensemencement en profondeur
Ajouter 1 ml de la suspension mère et/ou de la dilution d'échantillon préparée tel que validé (voir Article 13)
dans des boîtes de Pétri de 85 mm à 100 mm de diamètre et verser de 15 ml à 20 ml du milieu gélosé (5.4.2)
maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Pétri
plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de milieu gélosé en conséquence.
Mélanger la suspension mère et/ou la dilution d'échantillon avec le milieu en faisant soigneusement tourner
ou en inclinant suffisamment les boîtes de manière à assurer la dispersion. Laisser le mélange se solidifier
dans les boîtes de Pétri sur une surface horizontale à température ambiante.
9.3.2.2 Méthode par étalement en surface
Verser, dans des boîtes de Pétri de 85 mm à 100 mm de diamètre, de 15 ml à 20 ml de milieu gélosé (5.4.2)
maintenu en surfusion dans un bain-marie à une température ne dépassant pas 48 °C. Si des boîtes de Pétri
plus grandes sont utilisées, augmenter la quantité de milieu gélosé en conséquence. Laisser la gélose se
refroidir et se solidifier, par exemple sous hotte microbiologique ou dans un incubateur. Étaler un volume
mesuré supérieur ou égal à 0,1 ml de la suspension mère et/ou de la dilution d'échantillon préparée tel que
validé (voir Article 13) sur la surface du milieu.
9.3.2.3 Méthode par filtration sur membrane
Utiliser une membrane dont le diamètre nominal des pores n'excède pas 0,45 µm.
Transférer sur la membrane une quantité appropriée de la suspension mère ou de la dilution d'échantillon
préparée tel que validé (représentant de préférence au moins 1 g ou 1 ml du produit). Filtrer immédiatement
et laver la membrane (suivre le mode opératoire mis au point au cours de la validation, voir Article 13).
Transférer la membrane sur la surface du milieu gélosé (5.4.2).
9.3.2.4 Incubation
Sauf indication contraire, retourner les boîtes ensemencées et les placer dans l'incubateur à 32,5 °C ± 2,5 °C
pendant 72 h ± 6 h. Après incubation, les boîtes doivent être immédiatement examinées, dans la mesure du
possible. Autrement, elles peuvent être conservées au plus pendant 24 h au réfrigérateur, sauf indication
contraire.
NOTE Dans certains cas, lorsque les particules du produit risquent d'être confondues avec les colonies dénombrées,
il peut être utile de dupliquer des boîtes contenant l
...