ISO 16649-1:2001
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 1: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 1: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli bêta-glucuronidase positive — Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 degrés C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl bêta-D glucuronide
La présente partie de l'ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli bêta-glucuronidase positive dans des produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux. Elle utilise une technique de comptage des colonies après revivification au moyen de membranes puis incubation à 44 °C sur un milieu solide contenant un substrat chromogénique pour la détection de l'enzyme bêta-glucuronidase. AVERTISSEMENT - Certaines souches d'Escherichia coli qui ne poussent pas à 44 °C et, en particulier, celles qui sont bêta-glucuronidase négative, telles que les Escherichia coli O157, ne peuvent pas être mises en évidence.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16649-1
Première edition
2001-04-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
enumeration of����-glucuronidase-positive
Escherichia coli —
Part 1:
Colony-count technique at 44 °C using
membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
����-D-glucuronide
Mircobiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement
des Escherichia coli�-glucuronidase positive —
Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de
membranes et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D glucuronate
Reference number
ISO 16649-1:2001(E)
©
ISO 2001
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but shall not
be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In downloading this
file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat accepts no liability in this
area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation parameters
were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In the unlikely event
that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2001
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO's member body
in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Printed in Switzerland
ii © ISO 2001 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this part of ISO 16649 may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 16649-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products,
Subcommittee SC 9, Microbiology.
ISO 16649 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding stuffs —
Horizontal method for the enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli:
� Part 1: Colony-count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
� Part 3: Most probable number technique
© ISO 2001 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this part of ISO 16649 is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding the
extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this method in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products, International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped
that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this part of ISO 16649 so that
eventually the only remaining departures from this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
This International Standard describes two horizontal methods (ISO 16649-1 and ISO 16649-2) for the enumeration
of�-glucuronidase-positive Escherichia coli.
The user may choose either ISO 16649-1 or ISO 16649-2. Either part is for general application. However,
ISO 16649-1 should be used for foodstuffs which may contain severely stressed cells.
iv © ISO 2001 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16649-1:2001(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the enumeration of ��-glucuronidase-positive
��
Escherichia coli —
Part 1:
Colony-count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl ��-D-glucuronide
��
1 Scope
This part of ISO 16649 specifies a horizontal method for the enumeration of �-glucuronidase-positive Escherichia
coli in products intended for human consumption or for the feeding of animals. It uses a colony-count technique
after resuscitation using membranes and incubation at 44 °C on a solid medium containing a chromogenic
ingredient for detection of the enzyme�-glucuronidase.
WARNING — Strains of Escherichia coli which do not grow at 44 °C and, in particular, those that are
����-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157, will not be detected.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this part of ISO 16649. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these publications
do not apply. However, parties to agreements based on this part of ISO 16649 are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For undated
references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations.
3 Terms and definitions
For the purposes of this part of ISO 16649, the following terms and definitions apply.
3.1
����-glucuronidase-positive Escherichia coli
bacteria which at 44 °C form typical blue colonies on tryptone-bile-glucuronide medium (TBX) under the conditions
specified in this part of ISO 16649
3.2
enumeration of����-glucuronidase-positive Escherichia coli
determination of the number of colony-forming units (CFU) of �-glucuronidase-positive Escherichia coli, per millilitre
or per gram of sample, when test and calculations are carried out in accordance with this part of ISO 16649
© ISO 2001 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
4Principle
4.1 A specified quantity of the test sample or initial suspension is inoculated onto cellulose membranes overlaid
on mineral-modified glutamate agar (MMGA), then incubated at 37 °Cfor4h.
Under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or of the initial suspension, two plates per
dilution are inoculated.
4.2 For isolation, the membranes from the resuscitation stage on the MMGA are transferred to tryptone-bile-
glucuronide agar (TBX), then incubated at 44 °C for 18 h to 24 h.
4.3 The number of colony-forming units (CFU) of �-glucuronidase-positive Escherichia coli per gram or per
millilitre of sample is calculated from the number of typical blue CFU (see clause 10).
5 Diluent and culture media
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.1 Diluent
See ISO 6887-1 or the specific International Standard dealing with the product to be examined.
5.2 Culture media
5.2.1 Resuscitation medium: Mineral-modified glutamate agar (MMGA)
5.2.1.1 Composition
Sodium glutamate 6,35 g
Lactose 10,0 g
Sodium formate 0,25 g
L-(–)-Cystine 0,02 g
L-(–)-Aspartic acid 0,02 g
L-(+)-Arginine 0,024 g
Thiamine 0,001 g
Nicotinic acid 0,001 g
Pantothenic acid 0,001 g
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO �7H O) 0,100 g
4 2
a
Ammonium iron(III) citrate 0,010 g
Calcium chloride dihydrate (CaCl �2H O) 0,010 g
2 2
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO)0,900g
2 4
Ammonium chloride 2,5 g
b
Agar 9gto18 g
Water 1 000 ml
a
Iron content at least 15 % (by mass).
b
Depending on the gel strength of the agar.
2 © ISO 2001 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
5.2.1.2 Preparation
Dissolve the ammonium chloride in the water. Add the other components and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,7� 0,2 at 25 °C.
Transfer aliquots of up to 500 ml to suitable containers (6.10).
Sterilize in the autoclave (6.1) set at 115 °C for 10 min.
5.2.1.3 Preparation of agar plates
Pour 12 ml to 15 ml of the medium into sterile Petri dishes (6.11) and allow to solidify.
Dry the plates (see ISO 7218). The plates may be stored at 3 °C� 2 °C for up to 5 days.
The agar should be dry enough to allow excess moisture to disappear within 15 min of spreading the inoculum
(1 ml).
5.2.2 Selective medium: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)
5.2.2.1 Composition
Enzymatic digest of casein 20,0 g
Bile salts No. 3 1,5 g
a
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-�-D-glucuronic acid (BCIG)
144�mol
b
3ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
c
Agar
9gto18 g
Water 1 000 ml
a
For example, 0,075 g of cyclohexylammonium salt.
b
Dimethyl sulfoxide is harmful by inhalation and contact. The use of a fume
cupboard when handling is advised. Because of this toxicity, a diluent
recommended by the manufacturer may be used.
c
Depending on the gel strength of the agar.
5.2.2.2 Preparation
Dissolve the BCIG in the dimethyl sulfoxide or in the diluent recommended by the manufacturer. Dissolve all
components in the water and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 7,2� 0,2 at 25 °C.
Sterilize the medium in the autoclave (6.1) set at 121 °C for 15 min.
5.2.2.3 Preparation of agar plates
Proceed as described in 5.2.1.3.
© ISO 2001 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16649-1:2001(E)
6 Apparatus and glassware
Usual microbiological equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
6.2 Incubators, capable of being maintained at 37 °C� 1 °C and at 44 °C� 1 °C.
6.3 Drying cabinet or ventilated oven, capable of being maintained between 25 °C� 1 °Cand 50 °C� 1 °C, or
a laminar airflow cabinet.
6.4 Refrigerator (for storage of prepared media), capable of operating at 3 °C� 2 °C.
6.5 Sterile and non-inhibitive membranes, made of cellulose acetate or mixed esters of cellulose, with
0,45µm to 1,2µm pore size and 85 mm diameter.
6.6 Blunt-ended forceps, sterile, of approximately 12 cm length.
6.7 pH-meter, capable of measuring to an accuracy of� 0,1 pH unit.
Its minimum measuring threshold shall be 0,01 pH unit. The pH-meter shall be equipped with either manual or
automatic temperature equalization.
6.8 Pipettes, total delivery (blow out), having wide openings and having a nominal capacity of 1 ml, graduated
in 0,1 ml divisions.
6.9 Measuring cylinders, of appropriate capacity for preparation of the media.
6.10 Test tubes, bottles or flasks, of suitable capacity for sterilization and storage of culture media.
6.11 Petri dishes, of app
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16649-1
Première édition
2001-04-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement des
Escherichia coli����-glucuronidase
positive —
Partie 1:
Technique de comptage des colonies à
44 °C au moyen de membranes et de
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D glucuronate
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
enumeration of�-glucuronidase-positive Escherichia coli —
Part 1: Colony-count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl�-D-glucuronide
Numéro de référence
ISO 16649-1:2001(F)
©
ISO 2001
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier peut
être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifiéà moins que l'ordinateur employéà cet effet ne bénéficie d'une licence autorisant
l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées acceptent de fait la
responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute responsabilité en la
matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la créationduprésent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du
fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir l'exploitation de
ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le
Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2001
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-aprèsouducomité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Imprimé en Suisse
ii © ISO 2001 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente partie de l’ISO 16649 peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 16649-1 a étéélaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 9, Microbiologie.
L'ISO 16649 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive:
� Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-
3-indolylβ-D-glucuronate
� Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
β-D-glucuronate
� Partie 3: Technique du nombre le plus probable
© ISO 2001 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
Introduction
En raison de la diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale ne soit pas
applicable dans tous ses détails à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées.
Néanmoins, tous les efforts doivent être faits pour appliquer cette méthode horizontale chaque fois que possible.
Lors du prochain réexamen périodique de la présente partie de l'ISO 16649, il sera tenu compte de toutes les
évolutions intervenues depuis sa publication et, notamment, dans quelle mesure la présente méthode horizontale
aura été suivie ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réaliséede façon immédiate; de ce fait, il peut déjà
exister des Normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent pas avec
la présente méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les aligner
avec les exigences de la présente partie de l'ISO 16649 et de ne conserver que les seules divergences justifiées
indispensables pour des raisons techniques.
La présente Norme internationale décrit deux méthodes horizontales (ISO 16649-1 et ISO 16649-2) pour le
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive.
L'utilisateur peut choisir aussi bien l'ISO 16649-1 que l'ISO 16649-2. Les deux parties sont d'application générale.
Toutefois, il est recommandé d'utiliser l'ISO 16649-1 pour les produits susceptibles de contenir des bactéries
sévèrement stressées.
iv © ISO 2001 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 16649-1:2001(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement des Escherichia coli ��-glucuronidase positive —
��
Partie 1:
Technique de comptage des colonies à 44 °Caumoyende
membranes et de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ����-D glucuronate
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli
β-glucuronidase positive dans des produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation
des animaux. Elle utilise une technique de comptage des colonies après revivification au moyen de membranes
puis incubation à 44 °C sur un milieu solide contenant un substrat chromogénique pour la détectiondel'enzyme
β-glucuronidase.
AVERTISSEMENT — Certaines souches d'Escherichia coli qui ne poussent pas à 44 °C et, en particulier,
celles qui sont β-glucuronidase négative, telles que les Escherichia coli O157, ne peuvent pas être mises
en évidence.
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente partie de l'ISO 16649. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente partie de l'ISO 16649 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
© ISO 2001 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 16649, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Escherichia coliβ-glucuronidase positive
bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies bleues caractéristiques sur le milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX),
dans les conditions spécifiées dans la présente partie de l'ISO 16649
3.2
dénombrement des Escherichia coliβ-glucuronidase positive
détermination du nombre d’unités formant colonie (UFC) d'Escherichia coliβ-glucuronidase positive, par millilitre ou
par gramme d'échantillon, lorsque l'essai et les calculs sont effectuésselon la méthode spécifiée dans la présente
partie de l'ISO 16649
4Principe
4.1 Ensemencement d'une quantité spécifiéede l'échantillon pour essai ou de la suspension mère sur les
membranes de cellulose posées sur le milieu de glutamate modifié (MMGA), puis incubation à 37 °C pendant 4 h.
Dans les mêmes conditions, ensemencement de deux boîtes par dilution, en utilisant les dilutions décimales
obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou à partir de la suspension mère.
4.2 Isolement par transfert des membranes du MMGA sur le milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX), puis
incubation à 44 °C pendant 18 h à 24 h.
4.3 Calcul du nombre d’UFC d'Escherichia coli β-glucuronidase positive par gramme ou par millilitre
d'échantillon, à partir du nombre d’UFC bleues caractéristiques (voir l’article 10).
5 Diluant et milieux de culture
Pour la pratique courante en laboratoire, voir l'ISO 7218.
5.1 Diluant
Voir l'ISO 6887-1 ou la Norme internationale spécifique traitant du produit à analyser.
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Milieu de revivification: Milieu au glutamate modifié (MMGA)
2 © ISO 2001 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
5.2.1.1 Composition
Glutamate de sodium 6,35 g
Lactose 10,0 g
Formiate de sodium 0,25 g
L-(–)-Cystine 0,02 g
L-(–)-Acide aspartique 0,02 g
L-(+)-Arginine 0,024 g
Thiamine 0,001 g
Acide nicotinique 0,001 g
Acide pantothénique 0,001 g
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7H O) 0,100 g
4 2
a
Citrate de fer ammoniacal(III) 0,010 g
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2H O) 0,010 g
2 2
Dihydrogénophosphate de potassium (K HPO)0,900g
2 4
Chlorure d'ammonium 2,5 g
b
Agar-agar 9 g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
Teneur en fer d'au moins 15 % (en masse).
b
Selon le pouvoir gélifiant de l’agar-agar.
5.2.1.2 Préparation
Dissoudre le chlorure d'ammonium dans l'eau. Ajouter les autres composants et porter àébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 6,7� 0,2 à 25 °C.
Répartir à raison de 500 ml au maximum dans des récipients appropriés (6.10).
Stériliser pendant 10 min à l'autoclave (6.1) régléà 115 °C.
5.2.1.3 Préparation des boîtes de milieu gélosé
Verser dans des boîtes de Petri stériles (6.11), de 12 ml à 15 ml du milieu, et laisser se solidifier.
Sécher les boîtes (voir l'ISO 7218). Les boîtes de Petri peuvent être conservées à 3 °C� 2 °Cjusqu’à 5 jours.
Il convient de laisser sécher suffisamment les boîtes pour permettre à l'humidité en excédent de disparaître dans
les 15 min qui suivent l'étalement de l'inoculum (1 ml).
5.2.2 Milieu sélectif: milieu tryptone-bile-glucuronide (TBX)
© ISO 2001 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16649-1:2001(F)
5.2.2.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 20,0 g
o
Sels biliaires N31,5g
a
Acide 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-glucuronique (BCIG) 144µmol
b
Sulfoxydedediméthyle (DMSO) 3ml
c
Agar-agar 9 g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
Soit, par exemple, 0,075 g de sel de cyclohexylammonium.
b
Le sulfoxyde de diméthyle est nocif par inhalation et contact. L'utilisation d'une
hotte fermée lors de sa manipulation est conseillée. Du fait de cette toxicité,un
diluent recommandé par le fabricant peut être utilisé.
c
Selon le pouvoir gélifiant de l’agar-agar.
5.2.2.2 Préparation
Dissoudre le BCIG dans le sulfoxyde de diméthyle ou dans le diluent recommandé par le fabricant. Dissoudre tous
les composants dans l'eau et porter àébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'aprèsstérilisation il soit de 7,2� 0,2 à 25 °C.
Stériliser le milieu pendant 15 min à l'autoclave (6.1) régléà 121 °C.
5.2.2.3 Préparation des boîtes de milieu sélectif
Procéder comme décrit en 5.2.1.3.
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
6.2 Étuves,réglables respectivement à 37 °C� 1 °Cet à 44 °C� 1 °C.
6.3 Enceinte de séchage ou étuve ventilée,pouvant être maintenue à une température comprise entre
25 °C� 1 °Cet 50 °C� 1 °C, ou hotte à flux laminaire.
6.4 Réfrigérateur (pour le stockage des milieux préparés), réglable à 3 °C� 2 °C.
6.5 Membranes stériles et non inhibitrices, fabriquées en acétate de cellulose ou en esters mixtes de
cellulose, ayant une ouverture de pores de 0,45µm à1,2µm etundiam ètrede85mm.
6.6 Pinces à extrémité plate,stériles, d'environ 12 cm de longueur.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de� 0,1 unité pH.
Son seuil minimal de mesure doit êtrede0,01unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de
compensation de température soit manuel soit automatique.
6.8 Pipettes àécoulement total, à large ouverture et d'une capacité nominale de 1 ml, graduées en 0,1 ml.
6.9 Éprouvettes graduées, d'une capacité adaptée pour la préparation des milieu
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.