ISO 21148:2005

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21148
First edition
2005-10-15

Cosmetics — Microbiology — General
instructions for microbiological
examination
Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les
examens microbiologiques




Reference number
ISO 21148:2005(E)
©
ISO 2005

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ISO 21148:2005(E)
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope .1
2 Terms and definitions .1
3 Premises .1
4 Equipment .3
5 Strains of microorganisms .6
6 Personnel.6
7 Preparation of the apparatus and glassware.6
8 Preparation and sterilization of culture media and reagents.8
9 Laboratory samples.10
10 Operating practices .12
11 Expression of results .13
12 Neutralization of the antimicrobial properties of the product.13
Annex A (informative) Basic identification techniques.14
Annex B (informative) Basic techniques for counting and plating .19
Annex C (informative) Preparation and calibration of inoculums.20

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ISO 21148:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 21148 was prepared by Technical Committee ISO/TC 217, Cosmetics.
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ISO 21148:2005(E)
Introduction
The purpose of this International Standard is to help ensure that the general techniques used for conducting
cosmetic microbiological examinations are the same in other laboratories that adopt these standards, to help
achieve homogeneous results in different laboratories and to contribute towards the protection of the health of
the laboratory personnel by preventing risk of infection.
When conducting microbiological examinations for cosmetic products, it is especially important that:
⎯ only those microorganisms which are present in the samples be isolated or enumerated;
⎯ the microorganisms do not contaminate the environment.
In order to achieve this, it is necessary to pay attention to personal hygiene and to use working techniques
which ensure, as far as possible, exclusion of extraneous contamination.
Since, in this International Standard it is possible to give only a few examples of the precautions to be taken
during microbiological examinations, a thorough knowledge of the microbiological techniques and of the
microorganisms involved is essential. It is important that the analyses be conducted as accurately as possible,
including calculation of the number of microorganisms.
A large number of manipulations can, for example, unintentionally lead to cross-contamination and the analyst
should always verify the accuracy of the results given by his/her technique. It is necessary to take special
precautions, not only for reasons of hygiene, but also to ensure good reproducibility of the results. It is not
possible to specify all the precautions to be taken in all circumstances, but this International Standard at least
provides the main measures to be taken when preparing, sterilizing and storing the media and the equipment.
The given recommendations will allow enumeration and detection of mesophilic microorganisms which may
grow under aerobic conditions.
The recommendations are applicable to the determination of the absence of, or limited occurrence of specified
microorganisms that are of interest for cosmetic products.
The test methods are described in the individual standards. Alternative microbiological procedures can be
used provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise validated.
The choice of a specific method, or combination of methods mentioned in these International Standards will
depend on the purpose for performing the test and it is for the user to decide which approach is best for
his/her application.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21148:2005(E)

Cosmetics — Microbiology — General instructions for
microbiological examination
1 Scope
This International Standard gives general instructions for carrying out microbiological examinations of
cosmetic products, in order to ensure their quality and safety, in accordance with an appropriate risk analysis
(e.g. low water activity, hydro-alcoholic, extreme pH values).
Because of the large variety of products and potential uses within this field of application, these instructions
might not be appropriate for some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products).
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
2.2
sample
portion of the product (at least 1 g or 1 ml) which is used in the test to prepare the initial suspension
2.3
initial suspension
suspension (or solution) of a sample in a defined volume of an appropriate liquid (diluent, neutralizer, broth or
combination of them)
2.4
sample dilution
dilution of the initial suspension
3 Premises
3.1 Test areas
The areas required for the specific operation of a microbiology laboratory are as follows:
⎯ receipt, storage, preparation and processing of the samples;
⎯ preparation and sterilization of culture media, apparatus and glassware;
⎯ performance of analyses: weighing, dilutions, inoculations, subculturing, incubation, maintenance of the
strain, etc.;
⎯ decontamination and cleaning of apparatus, glassware, and processing of the analysis waste.
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3.2 Additional areas
The areas included in this category are, for example:
⎯ entrances, corridors, stairways, lifts;
⎯ administrative areas (e.g. secretarial, offices, documentation rooms, etc.);
⎯ cloakrooms and toilets;
⎯ archive rooms;
⎯ stores.
3.3 Location of the premises
The environment within which the microbiological analyses are carried out shall not affect the reliability of the
analyses.
Care shall be taken to locate the premises so as to avoid risk of cross-contamination.
Care shall be taken to ensure protection against extreme conditions such as excess temperature, dust,
humidity, steam, noise, vibration, exposure to direct sunlight, etc.
The surface area shall be sufficiently large to keep the work areas clean and orderly.
During the course of the tests, care shall be taken to limit access to the test areas to only those persons
required to conduct the tests.
Separate rooms and/or separate areas and/or specific enclosures should be provided for the following:
⎯ receipt, storage and preparation of samples;
⎯ manipulation of microbial cultures;
⎯ preparation of culture media, apparatus and glassware;
⎯ decontamination and washing area;
⎯ sterilization;
⎯ incubators, refrigerators and freezers.
3.4 Equipping the premises
3.4.1 The test premises shall be fitted out in the following ways in order to reduce the risks of contamination
by dust and therefore by microorganisms:
⎯ walls, ceilings and floors should be smooth, non-porous, easy to clean, and resistant to detergents and
disinfectants used in laboratories;
⎯ overhead pipes conveying fluids should not cross the premises unless they are hermetically enclosed;
⎯ sun-protection systems, when used, shall be installed on the outside of the windows, where practicable;
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⎯ windows and doors shall be able to be closed when conducting the test in order to minimize draughts.
Furthermore, they shall be designed so as to avoid the formation of dust traps and hence, to facilitate the
cleaning.
3.4.2 The ambient temperature and air quality (microorganism content, humidity, dust-spreading rate, etc.)
shall be compatible with carrying out the tests.
According to needs, a filter-ventilation and/or a microbiological cabinet are recommended for this purpose.
3.4.3 The laboratory bench tops and furniture shall be made of smooth, non-porous impermeable materials,
which are easy to clean and disinfect. Cabinet and equipment tops should be accessible for cleaning.
Non-fixed laboratory furniture shall be designed so as to facilitate cleaning the floors.
It is desirable that documents or books that are not frequently used be kept outside the test areas.
3.5 Maintenance
The floors, walls, ceiling, laboratory bench tops and furniture shall be maintained in good order to avoid cracks
where dirt might particularly accumulate and thus cause a source of contamination.
Regular cleaning and, when relevant, disinfection shall be carried out in order to keep the premises in a
condition suitable for conducting tests.
The ventilation systems and their filters shall be regularly maintained and filters changed when necessary.
4 Equipment
4.1 General
In general, all equipment shall be kept clean and in proper working condition.
Maintenance operations should be monitored. The measurement instruments and apparatus shall be regularly
verified according to an appropriate timetable and results recorded.
4.2 Microbiological cabinets
Cabinets are of two types:
a) clean-air cabinets, which are intended to protect the product from extraneous contamination and to
minimize contamination due to the operator;
b) safety cabinets, which are intended to protect the product from extraneous contamination, and also to
protect the operator and the environment.
Either cabinet can be used. Safety cabinets should be used for all work involving risk for the operator.
A cabinet is a dust-free workstation equipped with vertical laminar airflow. In microbiology, a safety cabinet is
used to retain the microorganisms on filters.
4.3 Balances
A microbiology laboratory for analyses of cosmetic products should be equipped with balances of the required
range and accuracy for the different products to be weighed. Generally, the accuracy required for weighing the
samples to be analysed and some components of the culture media and reagents, is ± 0,01 g.
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4.4 Homogenizer
This equipment (e.g. blender, stomacher, etc.) may be used to prepare the initial suspension from the test
samples of non-liquid products.
4.5 pH–meter
The pH-meter should be capable of measuring to an accuracy of ± 0,1 pH units and its minimum measuring
threshold shall be 0,01 pH units.
4.6 Autoclave
The autoclave shall be kept in good operating condition and shall regularly be inspected by the competent
departments in accordance with the manufacturer’s instructions and proper documentation should be
recorded.
The autoclave shall not be used to sterilize both clean materials and also to decontaminate used materials at
the same time. Wherever possible, separate autoclaves for these two processes should be used.
4.7 Incubator
Incubators shall be equipped with a regulation system which allows the temperature to be kept even and
stable over their entire working volume.
If the ambient temperature is close to, or higher than, that of the incubator, use an incubator with a cooling
system.
Incubators should be protected from direct sunlight.
If possible, incubators should not be completely filled in one single operation because the culture media will
take a long time to equilibrate to temperature, whatever type of incubator is used (forced-air convection or
otherwise).
The temperature shall be checked and recorded at least every working day.
4.8 Water baths
Water baths are of two types:
⎯ thermostatically-controlled baths, suitable for incubation of inoculated culture media, for identification
tests, etc.;
⎯ temperature-controlled water baths for maintenance of sterile agar media in a molten state for later use in
specified procedures.
The required temperature and accuracy are stipulated in each method of application.
4.9 Refrigerator or cold-storage room
The temperature, unless otherwise specified, shall be 5 °C ± 3 °C.
4.10 Freezer
The temperature, unless otherwise specified, shall be below − 18 °C.
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4.11 Sterilizing oven
A sterilizing oven is a chamber which allows the destruction of microorganisms by dry heat.
The temperature shall be evenly distributed within the chamber.
The oven shall be equipped with:
⎯ a thermostat;
⎯ a thermometer or a recording thermocouple;
⎯ a duration indicator or a programmer/timer.
4.12 Colony-counting device
A colony-counting device may be used.
4.13 Other equipment
WARNING — Volumetric glassware shall not be sterilized in a sterilizing oven.
Other equipment and apparatus for everyday use, include the following:
a) filtration apparatus (see below);
b) glass or plastic containers (test tubes, flasks, bottles);
c) glass or plastic Petri dishes (most commonly between 85 mm and 100 mm in diameter);
d) glass or plastic pipettes (10 ml, 2 ml, 1 ml), automatic pipettes;
e) sampling instruments;
f) wires and loops (of nickel/ chromium, platinum/ iridium or disposable plastic, etc.);
g) optical microscope;
h) gas burner or wire incinerator;
i) dispenser for culture media and reagents;
j) mechanical stirrer.
If the membrane filtration method is used, the equipment shall also include:
⎯ a membrane filtration system or filtration apparatus constructed of a suitable material, with a filter holder
of at least 50 ml, and suitable for use of filters with diameter 47 mm to 50 mm and not more than 0,45 µm
pore size;
⎯ the type of membrane material is chosen in such a way that the bacteria are not affected by the residual
components of the sample to be investigated;
⎯ a vacuum source able to give an even filtration flow rate (the device shall be set as to obtain the filtration
of 100 ml of liquid in less than 2 min).
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5 Strains of microorganisms
The strains needed for the validation of the methodology are indicated in each method of application.
6 Personnel
6.1 Competence
All personnel working in a microbiology laboratory shall have received adequate training to enable them to
conduct properly the operations entrusted to them.
The personnel who perform the tests shall have a good knowledge and sufficient practical experience with
microbiological techniques and the microorganisms sought. The person in charge shall be able to interpret the
accuracy and precision required to yield acceptable results.
6.2 Hygiene
In the field of personal hygiene, the following precautions shall be taken not only in order to avoid
contaminating the samples and culture media, but also in order to avoid risk of personnel infection:
⎯ wear laboratory clothing that is light-coloured, clean and in good condition, manufactured from a fabric
which limits the risks of flammability; this clothing shall not be worn outside the work areas;
⎯ keep nails perfectly clean and well groomed, and preferably short;
⎯ wash hands, before and after microbiological examinations and immediately after visiting the toilets or
eating; for drying hands, use disposable paper or disposable cloth towels;
⎯ when inoculating, avoid speaking, coughing, etc;
⎯ do not smoke, drink or eat in the test areas;
⎯ do not put food for personal consumption in the laboratory refrigerators;
⎯ special precautions shall be taken by persons having infections or illnesses that are likely to contaminate
samples with microorganisms and may invalidate results.
7 Preparation of the apparatus and glassware
7.1 Preparation
The apparatus and glassware used in microbiology shall be prepared in such a manner as to guarantee its
cleanliness and/or sterility up until the time of use.
Stopper tubes and cap bottles by appropriate material prior to sterilization.
Stopper the pipettes with cotton or any other appropriate material.
If necessary, the apparatus and glassware to be sterilized should be placed in special containers or wrapped
in an appropriate material (e.g. special paper, aluminium, etc.).
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ISO 21148:2005(E)
7.2 Sterilization
7.2.1 Sterilization by dry heat
Heat in sterilizing oven for at least 1 h at 170 °C to 180 °C or use any combination of time and temperature if
they are validated.
Indicators can be used in order to make certain that the sterilization has been achieved.
7.2.2 Sterilization by moist heat
Heat for at least 15 min at minimum of 121 °C in an autoclave. Indicators can be used in order to make certain
that the sterilization has been achieved.
7.3 Disposable apparatus
Disposable apparatus may be used in the same way as the re-usable glassware (Petri dishes, pipettes, tubes,
etc.) if the specifications are similar.
In this case, contact the manufacturer to determine that the proposed apparatus and glassware is suitable for
use in microbiology (in particular sterility) and that the material contains no substances that inhibit the growth
of microorganisms.
Disposable apparatus shall be decontaminated prior to its disposal. Other than the methods described in 7.6,
and depending upon national regulations, incineration may be used. If there is an incinerator on the premises,
decontamination and disposal may be achieved in a single operation.
7.4 Management of clean apparatus and glassware
Clean apparatus and glassware shall be protected against external contamination during storage, under
conditions which maintain their cleanliness.
7.5 Management of sterile apparatus and glassware
Prior to use, the apparatus and glassware shall be stored under conditions which allow them to remain sterile.
Disposable apparatus and glassware shall be stored in accordance to the manufacturer’s specifications,
without any damage to the packaging; laboratory-prepared apparatus and glassware shall be stored in clean
containers.
When sterilizing apparatus and glassware intended for microbiology, an expiry date (or a manufacturing date)
shall be put on each packaging. Hermetically sealed apparatus and glassware can be stored for up to
3 months prior to use unless otherwise specified.
7.6 Treatment of contaminated material
After use (culture of microorganisms or material in contact with microorganisms), the apparatus and glassware
and their contents shall be treated for destruction of microorganisms, prior to cleaning or disposal, whatever
the microorganism involved.
According to the nature of the materials, disinfection (10.1), sterilization (7.2) or incineration of disposable
material (7.3) may be used.
7.7 Washing
Wash apparatus and glassware after they have been treated (7.6).
Empty the containers of their contents.
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ISO 21148:2005(E)
Prior to washing, separate seals from stoppers or caps, as appropriate.
Rinse detergent residue from equipment with tap water. Rinse clean equipment with water 8.2.
In the absence of any commercial product, a sodium carbonate solution of 0,125 % (mass fraction) can be
[6]
used, followed by immersion in diluted acid [e.g. hydrochloric acid c(HCl) = 0,1 mol/l].
Specialized apparatus and glassware may be used in order to facilitate cleaning operations (e.g. pipette
washers, dishwashers, ultrasonic baths, etc.).
8 Preparation and sterilization of culture media and reagents
8.1 General
The accurate preparation of culture media is one of the fundamental steps in microbiological analysis and it
shall be given special care.
8.2 Water
WARNING — Water processed through an ion exchanger (de-ionized), may have a high
microorganism content; it is therefore advisable not to use such water without verifying that the
microorganism content of the water is low. Consult the manufacturer for the best way to minimize
microbial contamination. Heavily contaminated deionized water that has been filter sterilized may still
contain substances inhibitory to the growth of some microorganisms.
[2] [9] [11] [8]
Use distilled water or water of equivalent quality i.e. purified water or deionized water . If the
distilled water is prepared from chlorinated water, neutralize the chlorine prior to the distillation.
The water shall be stored in containers manufactured of inert materials (e.g. neutral glass, polyethylene, etc.).
8.3 Preparation of culture media
8.3.1 General
Two types of culture media preparation exist:
⎯ from basic ingredients, dehydrated or not; or
⎯ from dehydrated complete media.
Follow the manufacturer's specified storage conditions and expiration date.
Do not use the culture media beyond the stated shelf life.
Protect laboratory culture media that is in dehydrate from absorbing additional moisture from the environment
during storage and use.
8.3.2 Rehydration
Follow the manufacturer's recommendation for rehydration.
8.3.3 Measurement of pH
Measure the pH using a pH-meter (4.5) and adjust it, if necessary, so that, after sterilization and cooling down
to room temperature, the medium is at the required pH ± 0,2 units, unless otherwise stated.
8 © ISO 2005 – All rights reserved

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ISO 21148:2005(E)
NOTE The adjustment is normally carried out using a solution of approximately 40 g/l (about 1 mol/l) of sodium
[6]
hydroxide (NaOH) or approximately 36,5 g/l (about 1 mol/l) of hydrochloric acid (HCl).
8.3.4 Dispensing
Dispense the medium into appropriate containers, either manually or using automatic apparatus.
8.4 Sterilization
8.4.1 General
The sterilization of culture media and reagents can be carried out using various techniques, including:
⎯ sterilization by moist heat;
⎯ sterilization by filtration.
According to the technique used, once sterilized, the media should be monitored, in particular with respect to
pH, colour, sterility and microbiological performance.
8.4.2 Sterilization by moist heat
Use an autoclave (4.6) for sterilization. Generally, the sterilization step takes 15 min or longer at 121 °C.
Adapt the sterilization cycle as necessary for the volume and number of containers, the loading pattern, and
the media type.
The performance of the sterilization shall be verified using appropriate means.
8.4.3 Sterilization by filtration
Sterilization by filtration can be performed under vacuum or at pressurized conditions.
Use sterile membranes and filter elements with a pore diameter of 0,22 µm (except in certain cases, where
0,45 µm can be used). Refer to the manufacturer’s instructions regarding the use of filter elements or
membranes which have been purchased in a sterile condition.
Sterilize the different components of the filtration apparatus, assembled or not, in the autoclave for 15 min at
121 °C. If necessary, aseptic assembly can be performed in a microbiological cabinet after autoclaving.
Certain appliances can be purchased in a sterile condition.
8.5 Storage
8.5.1 General
Each package of bottles, tubes and Petri dishes shall be labelled and shall bear the following details:
⎯ name of the medium;
⎯ date of preparation and/or expiry date.
8.5.2 Laboratory-prepared culture media and reagents
Culture media dispensed in tubes or bottles and reagents which are not used immediately shall be protected
against light and desiccation using appropriate inert stoppers or screw-on lids with inert liners.
They shall be kept under conditions which prevent their composition from being modified.
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ISO 21148:2005(E)
Never use media which have become dehydrated.
Prior to use, it is desirable that the temperature of the culture media be equilibrated to that of the laboratory,
unless otherwise specified.
EXAMPLE TSA medium, prepared in the laboratory, is to be kept in flasks and stored in the dark, generally for no
more than two months, unless otherwise specified.
8.5.3 Ready-to-use culture media and reagents
It is necessary to comply with the manufacturer’s instructions:
⎯ expiry date,
⎯ storage temperature and conditions,
⎯ conditions for use (pH, etc.), and
⎯ efficiency control.
8.6 Melting of agar culture media
Melt a culture medium by placing it in boiling water bath or by any other process which gives identical result
(e.g. a steam flow-through autoclave).
Avoid over-heating and remove the culture medium, as soon as it has melted. Keep the culture medium in a
molten state in a water bath kept at no more than 48 °C until such time as it is to be used. Never use culture
medium at a temperature higher than 48 °C. It is preferable not to keep a molten medium more than 8 h. In
the case of particularly sensitive culture media, the melting duration shall be shortened.
No unused medium shall be resolidified for subsequent use.
8.7 Preparation of Petri dishes
Pour the molten agar culture med
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21148
Première édition
2005-10-15


Cosmétiques — Microbiologie —
Instructions générales pour les examens
microbiologiques
Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological
examination




Numéro de référence
ISO 21148:2005(F)
©
ISO 2005

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ISO 21148:2005(F)
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ii © ISO 2005 – Tous droits réservés

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ISO 21148:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Locaux . 1
4 Équipement . 3
5 Souches de microorganismes. 6
6 Personnel. 6
7 Préparation du matériel et de la verrerie. 7
8 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs . 8
9 Échantillons pour laboratoire. 11
10 Pratiques de laboratoire. 12
11 Expression des résultats . 14
12 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit. 14
Annexe A (informative) Techniques de base d’identification. 15
Annexe B (informative) Techniques de base de comptage et d’étalement . 20
Annexe C (informative) Préparation et étalonnage des inoculums . 21
Bibliographie . 22

© ISO 2005 – Tous droits réservés iii

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ISO 21148:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 21148 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 217, Cosmétiques.
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés

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ISO 21148:2005(F)
Introduction
Le but de la présente Norme internationale est d’aider à s’assurer que les techniques générales utilisées pour
effectuer les examens microbiologiques des cosmétiques sont les mêmes dans tous les laboratoires ayant
adopté ces normes, de participer ainsi à l’homogénéité des résultats obtenus dans différents laboratoires et
de contribuer à la protection de la santé du personnel de laboratoire en évitant les risques d’infection.
Lorsque des examens microbiologiques sont effectués sur des produits cosmétiques, il est spécialement
important
⎯ d’isoler ou de dénombrer seulement les microorganismes présents dans les échantillons,
⎯ que les microorganismes ne contaminent pas l’environnement.
Pour cela, il faut veiller à l’hygiène personnelle et utiliser des techniques de travail qui assurent autant que
possible l’absence de contamination étrangère.
Puisqu’il n’est possible de donner dans la présente Norme internationale que quelques exemples des
précautions à prendre pendant les examens microbiologiques, la connaissance approfondie des techniques
microbiologiques et des microorganismes en question est essentielle. Il faut donc que les analyses soient
conduites avec la plus grande rigueur possible, y compris pour le calcul du nombre de microorganismes.
De nombreuses manipulations peuvent, par exemple, entraîner involontairement une contamination croisée et
il convient que l’analyste vérifie toujours l’exactitude des résultats donnés par sa technique. Certaines
précautions sont à prendre, non seulement pour des raisons d’hygiène, mais également pour assurer une
bonne reproductibilité des résultats. Il n’est pas possible de spécifier toutes les précautions à prendre selon
les circonstances, mais la présente Norme internationale décrit au moins les dispositions principales à
prendre lors de la préparation, la stérilisation et la conservation des milieux et du matériel.
Les présentes recommandations permettent le dénombrement et la recherche des microorganismes
mésophiles capables de se développer dans des conditions aérobies.
Elles s’appliquent à la détermination de l’absence ou de la présence en quantité limitée de microorganismes
spécifiés présentant un intérêt pour des produits cosmétiques.
Les méthodes d’essai sont décrites dans les normes individuelles. D’autres modes opératoires
microbiologiques peuvent être suivis, à condition que leur équivalence ait été prouvée ou que la méthode ait
été validée par ailleurs. Le choix de la mise en œuvre d’une méthode spécifique ou d’une combinaison de
méthodes citées dans ces normes ISO dépend de l’objectif visé par l’essai et l’utilisateur doit décider quelle
approche est la plus adaptée pour leur mise en œuvre.

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NORME INTERNATIONALE ISO 21148:2005(F)

Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour
les examens microbiologiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale donne des règles générales pour la réalisation d’examens microbiologiques
sur des produits cosmétiques afin de garantir leur qualité et leur innocuité, conformément à une analyse de
risque appropriée (par exemple faible activité de l’eau, produit hydro-alcoolique, valeurs de pH extrêmes).
En raison de la grande variété de produits entrant dans le champ d’application de la présente norme et de
leurs usages potentiels, ces règles peuvent ne pas être adaptées en tout point à certains produits (par
exemple produits non miscibles à l’eau).
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
2.2
échantillon
portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée lors de l’essai pour préparer la suspension mère
2.3
suspension mère
suspension (ou solution) d’un échantillon dans un volume défini d’un liquide approprié (diluant, agent
neutralisant, bouillon ou combinaison de ceux-ci)
2.4
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension mère
3 Locaux
3.1 Zones d’essais
Les zones exigées pour la réalisation des diverses manipulations inhérentes à un laboratoire de microbiologie
sont les suivantes:
⎯ la réception, le stockage, la préparation et le traitement des échantillons;
⎯ la préparation et la stérilisation des milieux de culture, du matériel et de la verrerie;
⎯ la réalisation des analyses: pesées, dilutions, ensemencements, repiquages, incubation, conservation
des souches, etc.;
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ISO 21148:2005(F)
⎯ la décontamination et le nettoyage du matériel et de la verrerie ainsi que le traitement des déchets
d’analyse.
3.2 Zones annexes
Les zones faisant partie de cette catégorie sont, par exemple
⎯ les accès, couloirs, escaliers, monte-charges ou ascenseurs,
⎯ les espaces administratifs (par exemple, secrétariat, bureaux, salles de documentation, etc.),
⎯ les vestiaires et les sanitaires,
⎯ les salles d’archives,
⎯ les magasins.
3.3 Implantation des locaux
L’environnement dans lequel les analyses microbiologiques sont effectuées ne doit pas affecter leur fiabilité.
Les locaux doivent être implantés de façon à éviter les risques de contamination croisée.
Une protection doit être assurée contre les conditions extrêmes telles que l’excès de température, de
poussière, d’humidité, de vapeur, de bruit, de vibration, d’exposition directe aux rayonnements solaires, etc.
L’espace doit être suffisant pour maintenir les zones de travail propres et en ordre.
Durant le déroulement des essais, l’accès aux zones d’essais doit être limité aux seules personnes en charge
de la réalisation des analyses.
Il convient de prévoir des salles indépendantes et/ou des zones séparées et/ou des enceintes spécifiques
pour
⎯ la réception, le stockage et la préparation des échantillons,
⎯ la manipulation des cultures microbiennes,
⎯ la préparation des milieux de culture, du matériel et de la verrerie,
⎯ la décontamination et le nettoyage,
⎯ la stérilisation,
⎯ les incubateurs, les réfrigérateurs et les congélateurs.
3.4 Aménagement des locaux
3.4.1 Les locaux d’essai doivent être aménagés de façon à réduire les risques de contamination par la
poussière et donc par les microorganismes:
⎯ il convient que les murs, plafonds et sols soient lisses, non poreux, faciles à nettoyer et résistants aux
produits détergents et aux désinfectants utilisés au laboratoire;
⎯ à moins qu’elles ne soient hermétiquement enfermées, il convient que les conduites de fluides ne
traversent pas les locaux en hauteur;
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ISO 21148:2005(F)
⎯ en cas d’utilisation de systèmes de protection contre les rayonnements solaires, ceux-ci doivent être
installés à l’extérieur des fenêtres, dans la mesure du possible;
⎯ les fenêtres et les portes doivent pouvoir être fermées lors des essais afin de limiter les courants d’air. En
outre, elles doivent être conçues de manière à éviter la formation des nids à poussière pour en faciliter le
nettoyage.
3.4.2 La température ambiante et la qualité de l’air (teneur en microorganismes, hygrométrie, taux
d’empoussièrement, etc.) doivent être compatibles avec la réalisation des essais.
Dans ce but, et selon les besoins, il est recommandé d’installer un système de ventilation filtrée et/ou une
hotte microbiologique.
3.4.3 Les paillasses et les mobiliers de laboratoire doivent être constitués de matériaux lisses, non poreux,
imperméables, faciles à nettoyer et à désinfecter. Il convient que le haut des hottes et des équipements soit
accessible pour le nettoyage.
Les mobiliers de laboratoire mobiles doivent être conçus pour faciliter le nettoyage des sols.
Il est souhaitable que les documents et livres qui ne sont pas fréquemment utilisés soient conservés à
l’extérieur des zones d’essais.
3.5 Entretien
Les sols, murs, plafonds, paillasses et mobiliers de laboratoire doivent être maintenus en bon état afin d’éviter
l’apparition de fissures qui pourraient créer des zones d’encrassement privilégiées et donc être sources de
contamination.
Un nettoyage et, le cas échéant, une désinfection doivent être effectués régulièrement afin de maintenir les
locaux dans un état compatible avec la réalisation des essais.
Les systèmes de ventilation et leurs filtres doivent être régulièrement entretenus et les filtres changés lorsque
cela est nécessaire.
4 Équipement
4.1 Généralités
De façon générale, tous les équipements doivent être maintenus propres et en bon état de fonctionnement.
Il convient d’assurer un suivi des opérations de maintenance. Les instruments de mesure et le matériel
doivent être vérifiés régulièrement conformément à une planification appropriée et les résultats doivent être
enregistrés.
4.2 Hottes microbiologiques
Les hottes sont de deux types:
a) les hottes à flux laminaire, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et de
réduire les contaminations dues à l’opérateur;
b) les hottes de sécurité, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et
également de protéger l’opérateur et l’environnement.
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ISO 21148:2005(F)
Ces deux types de hottes peuvent être utilisés. Il convient d’utiliser les hottes de sécurité pour tout travail
présentant un risque pour l’opérateur.
Une hotte est un poste de travail sans poussière, à flux d’air laminaire vertical. En microbiologie, une hotte de
sécurité est utilisée pour retenir les microorganismes sur des filtres.
4.3 Balances
Dans le cadre des analyses de produits cosmétiques, il est recommandé qu’un laboratoire de microbiologie
soit équipé de balances appropriées, en portée et en exactitude, aux différents produits à peser.
Généralement, l’exactitude requise pour peser les échantillons à analyser et certains composants des milieux
de culture et réactifs est de ± 0,01 g.
4.4 Homogénéisateur
Cet équipement (par exemple mélangeur, système Stomacher, etc.) peut être utilisé pour préparer la
suspension mère à partir des échantillons autres que les produits liquides.
4.5 pH-mètre
Il convient que le pH-mètre soit capable de réaliser des mesurages à ± 0,1 unité pH près et que son seuil
minimal de mesure soit de 0,01 unité pH.
4.6 Autoclave
L’autoclave doit être maintenu en bon état de fonctionnement et doit faire l’objet d’une inspection régulière par
les services compétents, conformément aux instructions du fabricant. Il convient de conserver les documents
justificatifs de cette inspection.
Lors d'un même cycle de stérilisation, l’autoclave ne doit pas être utilisé à la fois pour stériliser un matériel
propre et pour décontaminer un matériel déjà utilisé. Dans la mesure du possible, il est recommandé d’utiliser
des autoclaves séparés pour réaliser ces deux opérations.
4.7 Incubateur
Les incubateurs doivent être équipés d’un système de régulation permettant de maintenir une température
uniforme et stable dans l’ensemble de leur volume utile.
Si la température ambiante est proche de celle de l’incubateur ou plus élevée, utiliser un incubateur équipé
d’un système de refroidissement.
Il convient de protéger les incubateurs de l’exposition directe aux rayonnements solaires.
Dans la mesure du possible, il est recommandé de ne pas charger complètement l’incubateur en une seule
opération car le temps d’équilibrage de la température des milieux de culture sera long, quel que soit le type
d’incubateur utilisé (convection d’air forcé ou autre).
La température doit être contrôlée et enregistrée au moins tous les jours de travail.
4.8 Bains-marie
Les bains-marie sont de deux types:
⎯ les bains thermostatés, adaptés à l’incubation de milieux de culture ensemencés, aux essais
d’identification, etc.;
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ISO 21148:2005(F)
⎯ les bains à température contrôlée, adaptés au maintien des milieux gélosés stériles en surfusion pour un
usage ultérieur dans des modes opératoires spécifiés.
La température et l’exactitude exigées sont stipulées dans chaque méthode d’application.
4.9 Réfrigérateur ou chambre froide
La température, sauf spécification contraire, doit être de 5 °C ± 3 °C.
4.10 Congélateur
La température, sauf spécification contraire, doit être inférieure à − 18 °C.
4.11 Stérilisateur
Un stérilisateur est une enceinte permettant la destruction des microorganismes par chaleur sèche.
La répartition de la température dans l’enceinte doit être homogène.
Le stérilisateur doit être muni
⎯ d’un thermostat,
⎯ d’un thermomètre ou d’un thermocouple enregistreur,
⎯ d’un indicateur de durée ou d’un programmateur/minuteur.
4.12 Dispositif de comptage des colonies
Un dispositif de comptage des colonies peut être utilisé.
4.13 Autre équipement
AVERTISSEMENT — Aucune verrerie graduée ne doit être stérilisée dans un stérilisateur.
D’autres équipement et matériel sont d’utilisation courante, parmi lesquels:
a) appareillage de filtration (voir ci-dessous);
b) récipients en verre ou en plastique (tubes à essais, fioles, flacons);
c) boîtes de Pétri en verre ou en plastique (généralement de 85 mm et 100 mm de diamètre);
d) pipettes en verre ou en plastique (10 ml, 2 ml, 1 ml), pipettes automatiques;
e) instruments d’échantillonnage;
f) fils et anses (en nickel/chrome, en platine/iridium ou en plastique jetable, etc.);
g) microscope optique;
h) brûleur à gaz ou stérilisateur à fil;
i) répartiteur de milieux de culture et de réactifs;
j) agitateur mécanique.
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ISO 21148:2005(F)
En cas d’utilisation de la méthode de filtration sur membrane, l’équipement doit également inclure les
éléments suivants:
⎯ un filtre à membrane ou un dispositif de filtration constitué d’un matériau approprié, avec un porte-filtre
d’au moins 50 ml de capacité, compatible avec l’utilisation de filtres de 47 mm à 50 mm de diamètre et
dont le diamètre des pores n’excède pas 0,45 µm;
⎯ une membrane dont le matériau est sélectionné de telle manière que les composants résiduels de
l’échantillon à analyser soient sans effet sur les bactéries;
⎯ une source de vide capable de produire un débit de filtration homogène (le dispositif doit être réglé de
manière à filtrer 100 ml de liquide en moins de 2 min).
5 Souches de microorganismes
Les souches nécessaires à la validation de la méthodologie sont indiquées dans chaque méthode
d’application.
6 Personnel
6.1 Compétence
Toute personne travaillant dans un laboratoire de microbiologie doit avoir reçu une formation indispensable à
la bonne réalisation des opérations qui lui sont confiées.
Le personnel chargé de la réalisation des essais doit avoir une bonne connaissance et une pratique suffisante
des techniques microbiologiques et des microorganismes recherchés. Le responsable doit pouvoir interpréter
les notions d’exactitude et de fidélité requises pour obtenir des résultats acceptables.
6.2 Hygiène
Dans le domaine de l’hygiène personnelle, les précautions suivantes doivent être prises non seulement pour
éviter la contamination des échantillons et des milieux de culture mais également pour éviter les risques
d’infection du personnel:
⎯ porter des vêtements de laboratoire de couleur claire, propres et en bon état, fabriqués dans un tissu
limitant les risques d’inflammabilité; ces vêtements ne doivent pas être portés en dehors des locaux
d’essai;
⎯ garder des ongles parfaitement propres et soignés, de préférence courts;
⎯ se laver les mains avant et après les examens microbiologiques et immédiatement après chaque
passage aux toilettes ou après chaque repas; pour se sécher les mains, utiliser des serviettes en papier
ou en tissu, les deux étant à usage unique;
⎯ pendant les ensemencements, éviter de parler, de tousser, etc.;
⎯ ne pas fumer, boire ou manger dans les zones d’essais;
⎯ ne pas placer d’aliments destinés à la consommation personnelle dans les réfrigérateurs du laboratoire;
⎯ prendre des précautions particulières pour les personnes présentant des infections ou des maladies dont
les microorganismes responsables, susceptibles de contaminer les échantillons, risquent de fausser les
résultats.
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ISO 21148:2005(F)
7 Préparation du matériel et de la verrerie
7.1 Préparation
Le matériel et la verrerie utilisés en microbiologie doivent être préparés de façon à garantir leur propreté et/ou
leur stérilité jusqu’au moment de l’utilisation.
Les tubes et flacons doivent être bouchés par un moyen approprié avant stérilisation.
Les pipettes doivent être bouchées avec du coton ou tout autre matériau adéquat.
Il convient, si nécessaire, de placer le matériel et la verrerie à stériliser dans des récipients spéciaux ou de les
emballer dans un matériau approprié (par exemple papier spécial, aluminium, etc.).
7.2 Stérilisation
7.2.1 Stérilisation par chaleur sèche
Chauffer dans un stérilisateur pendant au moins 1 h entre 170 °C et 180 °C ou utiliser n’importe quelle
combinaison durée/température validée.
Des indicateurs peuvent être utilisés afin de s’assurer que la stérilisation a bien été accomplie.
7.2.2 Stérilisation par chaleur humide
Chauffer pendant au moins 15 min à une température minimale de 121 °C dans un autoclave. Des indicateurs
peuvent être utilisés afin de s’assurer que la stérilisation a bien été accomplie.
7.3 Matériel à usage unique
Le matériel à usage unique peut être utilisé au même titre que la verrerie réutilisable (boîtes de Pétri, pipettes,
tubes, etc.) si les spécifications sont similaires.
Dans ce cas, s’assurer auprès du fournisseur que le matériel et la verrerie proposés conviennent pour
l’utilisation en microbiologie (en particulier en matière de stérilité) et que le matériau ne contient aucune
substance susceptible d’inhiber la croissance des microorganismes.
Le matériel à usage unique doit être décontaminé avant son élimination. En fonction de la réglementation
nationale en vigueur, outre les méthodes citées en 7.6, l’incinération peut être utilisée. Si un incinérateur est
présent dans les locaux, la décontamination et l’élimination peuvent être réalisées en une seule opération.
7.4 Gestion du matériel et de la verrerie propres
Le matériel et la verrerie propres doivent être stockés dans des conditions assurant le maintien de leur
propreté et la protection contre les contaminations extérieures.
7.5 Gestion du matériel et de la verrerie stériles
Avant utilisation, le matériel et la verrerie doivent être stockés dans des conditions assurant le maintien de
leur stérilité. Le matériel et la verrerie à usage unique doivent être stockés conformément aux spécifications
du fabricant, sans détérioration des emballages; le matériel et la verrerie préparés au laboratoire doivent être
stockés dans des conteneurs propres.
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ISO 21148:2005(F)
Lors de la stérilisation du matériel et de la verrerie destinés à la microbiologie, une date limite d’utilisation (ou
une date de fabrication) doit être apposée sur chaque emballage. La durée de conservation maximale du
matériel et de la verrerie bouchés hermétiquement est, sauf spécification contraire, de 3 mois avant utilisation.
7.6 Traitement du matériel contaminé
Après utilisation (culture de microorganismes ou objet en contact avec les microorganismes), le matériel, la
verrerie et leur contenu doivent être traités pour détruire les microorganismes, avant tout nettoyage ou
élimination de ceux-ci, quel que soit le microorganisme en cause.
Selon la nature des matériaux, la désinfection (10.1), la stérilisation (7.2) ou l’incinération du matériel à usage
unique (7.3) peuvent être utilisées.
7.7 Lavage
Ne laver le matériel et la verrerie qu’après leur décontamination (7.6).
Vider les récipients de leur contenu.
Avant lavage, séparer les joints de leur bouchon, le cas échéant.
Éliminer les traces résiduelles de détergent à l’aide d’eau du robinet. Rincer l’équipement propre à l’eau (8.2).
En l’absence de produit du commerce, il est possible d’utiliser une solution de carbonate de sodium à 0,125 %
(fraction massique) puis de procéder à une immersion dans de l’acide dilué [par exemple acide chlorhydrique
[6]
c(HCl) = 0,1 mol/l].
Pour faciliter les opérations de nettoyage, un matériel et de la verrerie spécifiques peuvent être utilisés (par
exemple nettoyeur de pipettes, lave-vaisselle, cuves à ultrasons, etc.).
8 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs
8.1 Généralités
La préparation exacte des milieux de culture est une des étapes fondamentales de l’analyse microbiologique
et il est nécessaire d’y apporter toute la rigueur nécessaire.
8.2 Eau
AVERTISSEMENT — L’eau déionisée par passage sur résine échangeuse d’ions peut contenir de
fortes concentrations de microorganismes, aussi est-il conseillé de ne pas utiliser cette eau sans
vérifier sa faible teneur en microorganismes. Consulter le fabricant pour appliquer la meilleure
méthode de réduction de la contamination microbienne. De l’eau déionisée fortement contaminée peut
encore, après filtration stérilisante, contenir des substances inhibitrices de la croissance de certains
microorganismes.
[2] [9] [11]
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou de qualité équivalente, c’est-à-dire de l’eau purifiée ou
[8]
déionisée . Si l’eau distillée est préparée à partir d’eau chlorée, neutraliser le chlore avant la distillation.
L’eau doit être conservée dans des récipients en matériau inerte (par exemple verre neutre, polyéthylène,
etc.).
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ISO 21148:2005(F)
8.3 Préparation des milieux de culture
8.3.1 Généralités
Deux types de préparation existent:
⎯ à partir de composants de base, déshydratés ou non; ou
⎯ à partir de milieux complets déshydratés.
Respecter la date de péremption et les conditions de stockage indiquées par le fabricant.
Ne pas utiliser au-delà de la durée de stockage indiquée.
Protéger les milieux de culture déshydratés contre l’absorption d’humidité en cours de stockage et d’utilisation.
8.3.2 Réhydratation
Suivre les recommandations du fabricant.
8.3.3 Mesurage du pH
Mesurer le pH à l’aide d’un pH-mètre (4.5) et l’ajuster si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation et
refroidissement à température ambiante, le milieu soit au pH demandé à ± 0,2 unité pH près, sauf indication
contraire.
NOTE L’ajustement est généralement effectué avec une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) à environ 40 g/l
(approximativement 1 mol/l) ou avec une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à environ 36,5 g/l (approximativement
[6]
1 mol/l).
8.3.4 Répartition
Répartir le milieu dans des récipients appropriés, soit manuellement, soit à l’aide d’un appareillage
automatique.
8.4 Stérilisation
8.4.1 Généralités
La stérilisation des milieux de culture et des réactifs peut être réa
...