ISO 16256:2012

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16256
First edition
2012-12-01
Clinical laboratory testing and in vitro
diagnostic test systems — Reference
method for testing the in vitro activity
of antimicrobial agents against yeast
fungi involved in infectious diseases
Essais de laboratoire clinique et systèmes de diagnostic in vitro —
Méthode de référence pour soumettre à essai l’activité in vitro des
agents antimicrobiens par rapport aux levures impliquées dans les
maladies infectieuses
Reference number
ISO 16256:2012(E)
©
ISO 2012

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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Terms and definitions . 1
3 Test procedures . 4
3.1 General . 4
3.2 Medium . 4
3.3 Antifungal agents . 5
3.4 Storage of microdilution trays . 7
3.5 Preparation of inoculum — General . 8
3.6 Inoculation of microdilution trays . 8
3.7 Incubation of microdilution trays . 9
3.8 Reading MIC results . 9
3.9 Interpretation of MICs .10
4 Quality control (QC) .10
Annex A (informative) RPMI-1640 medium .13
Annex B (informative) McFarland 0,5 barium sulfate turbidity standard .15
Annex C (informative) Acceptable reading times for MIC interpretations using the visual MIC
reading procedure .16
Bibliography .17
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16256 was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in vitro
diagnostic test systems.
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ISO 16256:2012(E)

Introduction
In vitro susceptibility tests are performed on microorganisms suspected of causing disease, particularly
if the organism is thought to belong to a species that may exhibit acquired resistance to frequently used
antimicrobial agents. The tests are also important in resistance surveillance, epidemiological studies of
susceptibility and in comparisons of new and existing agents.
Dilution procedures are used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of antimicrobial
agents and represent the reference method for antifungal susceptibility testing. MIC methods are used
in resistance surveillance, comparative testing of new agents for research or registration purposes,
to establish the susceptibility of organisms that give equivocal results in routine tests, for tests with
organisms where routine tests may be unreliable and when a quantitative result is needed for clinical
management. In dilution tests, microorganisms are tested for their ability to produce discernible growth
on a series of agar plates (agar dilution) or in broth (broth dilution) containing serial dilutions of the
antimicrobial agent.
The lowest concentration of an antimicrobial agent (in mg/l) that, under defined in vitro test conditions,
reduces visible or optically measurable growth of a microorganism within a defined period of time
is known as the MIC. The MIC is a guide for the clinician to the susceptibility of the organism to the
antimicrobial agent and aids treatment decisions. Careful control and standardization is required
for intra- and inter-laboratory reproducibility, as results may be influenced by the method used. It is
generally accepted that broth MIC tests are reproducible to within one doubling dilution of the true end
point (i.e. ±1 well or tube in a doubling dilution series).
Broth dilution is a technique in which containers holding identical volumes of broth with antimicrobial
agent solutions in incrementally (usually twofold) increasing concentrations are inoculated with a
known number of microorganisms.
Broth microdilution denotes the performance of the broth dilution test in microdilution trays.
The reference methods described in this International Standard are intended for the testing of pure
cultures of yeast fungi. The broth microdilution methods described in this part of this International
Standard are essentially the same as those described by the Clinical and Laboratory Standards Institute
[1] [2]
(CLSI) and by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) . These
methods have been shown to provide MICs of fluconazole that are essentially the same, if not identical
[3]
up to 2 mg/l . Studies with various other antifungal agents are planned or under way. The laboratory
that wishes to use this International Standard for conducting studies of newer antifungal agents, or as
a reference method for comparison to MICs generated by a diagnostic device, should select which of the
procedure options to use based upon the choice of MIC reading determined by visual inspection (CLSI
method) or by use of a spectrophotometer (EUCAST method). In either case, the procedural details for
that option are to be followed explicitly.
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Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test
systems — Reference method for testing the in vitro
activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved
in infectious diseases
WARNING — The use of this International Standard may involve hazardous materials, operations
and equipment. This International Standard does not purport to address all of the safety problems
associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to
establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of regulatory
limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard describes a method for testing the susceptibility to antifungal agents of
yeasts, including Candida spp. and Cryptococcus neoformans, that cause infections. The reference method
described here has not been used in studies of the yeast forms of dimorphic fungi, such as B. dermatitidis
and/or H. capsulatum variety capsulatum. Moreover, testing filamentous fungi (moulds) introduces
several additional problems in standardization not addressed by the current procedure. Reference
methods for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi have been developed
[4][5][6][7][8]
and are now available as CLSI document M38 and EUCAST document E.DEF 9.1 .
This International Standard describes the broth microdilution reference method which can be
implemented by either of two pathways. One pathway involves visual determination of MICs (CLSI method)
[1] [2]
; the second pathway involves spectrophotometric determination of MICs (EUCAST method) . The
MIC reflects the activity of the drug under the described test conditions and can be interpreted for clinical
management purposes by taking into account other factors, such as drug pharmacology or antifungal
resistance mechanisms. MICs can be categorized as “susceptible” (S), “susceptible dose-dependent” (S-
DD), “intermediate” (I), “non-susceptible” (NS) or “resistant” (R). In addition, MIC distributions can be
used to define wild type or non-wild type fungal populations. Clinical interpretation of the MIC value is
beyond the scope of this International Standard; interpretive category breakpoints specific to the CLSI-
and EUCAST-derived methods can be found by consulting the latest interpretive tables provided by the
[2][9]
organizations . It is advisable to compare routine susceptibility testing methods or diagnostic test
devices with this reference method in order to ensure comparable and reliable results for validation or
registration purposes.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
antifungal agent
substance of biological, semi-synthetic or synthetic origin that inhibits the growth of or kills fungi, and
is thus of potential use in the treatment of infections
NOTE Disinfectants, antiseptics and preservatives are not included in this definition.
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2.2
antifungal agents — properties
2.2.1
potency
active fraction of a test substance, determined in a bioassay against a reference powder of the same substance
NOTE The potency is expressed as mass fraction in milligrams per gram (mg/g), or as activity content
in International Units (IU) per gram, or as a volume fraction or mass fraction in percent, or as an amount-of-
substance concentration (mass fraction) in mole per litre of ingredients in the test substance.
2.2.2
concentration
amount of an antifungal agent in a defined volume of liquid
NOTE 1 The concentration is expressed as mg/l.
NOTE 2 mg/l = µg/ml but use of the unit µg/ml is not recommended.
2.3
stock solution
initial solution used for further dilutions
2.4
minimum inhibitory concentration
MIC
lowest concentration that, under defined in vitro test conditions, reduces growth by an agreed amount
within a defined period of time
NOTE The MIC is expressed in mg/l.
2.5
breakpoint
BP
specific MIC values that can be used to assign fungi to the clinical categories “susceptible”, “susceptible
dose-dependent,” “intermediate,” “nonsusceptible” and “resistant”
NOTE For current interpretive breakpoints, reference can be made to the latest publications of organizations
[1][2][9]
employing the reference method (e.g. CLSI and EUCAST) .
2.5.1
visual reading pathway
2.5.1.1
susceptible
S
fungal strain inhibited in vitro by a concentration of an antifungal agent that is associated with a high
likelihood of therapeutic success
NOTE 1 Fungal strains are categorized as susceptible by applying the appropriate breakpoints in a defined
phenotypic test system.
NOTE 2 This breakpoint can be altered in certain circumstances (e.g. changes in commonly used drug dosages,
emergence of new resistance mechanisms).
2.5.1.2
susceptible dose-dependent
S-DD
fungal strain inhibited in vitro by a concentration of an antifungal agent that may be achieved in vivo by
using higher than normal doses of the agent when such dosage schedules can be safely employed
NOTE 1 Fungal strains are categorized as susceptible dose-dependent by applying the appropriate breakpoints
in a defined phenotypic test system.
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NOTE 2 This class of susceptibility implies that an infection due to the isolate can be appropriately treated in
body sites where the drugs are physiologically concentrated or when a high dosage of drug can be used.
NOTE 3 This breakpoint can be altered in certain circumstances (e.g. changes in commonly used drug dosages,
emergence of new resistance mechanisms).
2.5.1.3
intermediate
I
micro-organism having a level of antimicrobial agent activity associated with uncertain therapeutic effect
NOTE This implies that an infection due to the isolate may be appropriately treated in body sites where the
drugs are physically concentrated or when a high dosage of drug can be used; it also indicates a buffer zone that
should prevent small, uncontrolled, technical factors from causing major discrepancies in interpretations.
2.5.1.4
nonsusceptible
NS
category used for yeast fungi that currently have only a susceptible interpretive category, but not
susceptible dose-dependent, intermediate or resistant interpretive categories (i.e. susceptible-only
interpretive category)
NOTE This category is often given to new antifungal agents for which no resistant isolates have yet been
encountered.
2.5.1.5
resistant
R
fungal strain inhibited in vitro by a concentration of an antifungal agent that is associated with a high
likelihood of therapeutic failure
NOTE 1 Fungal strains are categorized as resistant by applying the appropriate breakpoints in a defined
phenotypic test system.
NOTE 2 This breakpoint can be altered in certain circumstances (e.g. changes in commonly used drug dosages,
emergence of new resistance mechanisms).
2.5.2
spectrophotometric reading pathway
2.5.2.1
susceptible
S
micro-organism having a level of antimicrobial activity associated with a high likelihood of
therapeutic success
2.5.2.2
intermediate
I
micro-organism having a level of antimicrobial agent activity associated with uncertain therapeutic effect
NOTE This implies that an infection due to the isolate may be appropriately treated in body sites where the
drugs are physically concentrated or when a high dosage of drug can be used; it also indicates a buffer zone that
should prevent small, uncontrolled, technical factors from causing major discrepancies in interpretations.
2.5.2.3
resistant
R
micro-organism having a level of antimicrobial activity associated with a high likelihood of
therapeutic failure
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2.6
wild type
absence of acquired resistance mechanisms to the antifungal agent in a given fungal strain
2.7
reference strain
catalogued, well-characterized fungal strain with stable, defined antifungal susceptibility phenotypes
and/or genotypes
NOTE Reference strains are kept as stock cultures, from which working cultures are derived. They are
obtainable from culture collections and used for quality control.
2.8
susceptibility testing method
2.8.1
broth dilution
technique in which containers are filled with appropriate volumes of an antifungal solution, employing
incrementally (usually two-fold) increasing concentrations of the antifungal agent and appropriate
volumes of broth with a defined inoculum
NOTE The aim of this method is the determination of the MIC.
2.8.2
microdilution
performance of broth dilution in microdilution trays with a capacity of ≤ 300 µl per well
2.9
broth
fluid medium used for the in vitro growth of yeast fungi
2.10
inoculum
number of yeast in a suspension, calculated with respect to the final volume
NOTE The inoculum is expressed as colony-forming units per millilitre (CFU/ml).
2.11
inoculum effect
change in MIC related to change in inoculum
3 Test procedures
3.1 General
The tests are performed in plastic disposable microdilution trays. The method is based on the preparation
of double strength antifungal agent working solutions in 100 µl volumes per well with the addition of an
inoculum also in a volume of 100 µl.
3.2 Medium
3.2.1 General
RPMI-1640 broth shall be used (see Appendix A for details for preparation of the two versions of RPMI-
1640 glucose broth).
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3.2.2 Visual reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 0,2 % glucose. The RPMI-1640 broth is prepared and dispensed
at single strength with double strength antifungal agent dilutions and the inoculum is delivered in equal
volumes of RPMI-1640 broth containing the adjusted yeast inoculum suspension.
3.2.3 Spectrophotometric reading pathway
The RPMI-1640 medium should contain 2 % glucose. The RPMI-1640 broth and antifungal agents are
both prepared at double strength with the inoculum subsequently added in an equal volume of sterile
distilled water.
3.3 Antifungal agents
3.3.1 General
Antifungal agents shall be obtained directly from the manufacturer or from reliable commercial sources;
pharmaceutical preparations for clinical use are not acceptable. The antifungal agents shall be supplied
with a lot number, potency, an expiry date and details of recommended storage conditions. Substances
shall be stored in tightly closed containers in the dark, at −20 °C, with a desiccant unless otherwise
recommended by the manufacturer. Hygroscopic agents should be dispensed into aliquots, one of which
is used on each test occasion.
Allow containers to warm to room temperature before opening them in order to avoid condensation and
loss of potency.
3.3.2 Preparation of stock solutions
The use of a calibrated analytical balance is required for weighing antifungal agents. Allowance for the
potency of the powder shall be made by use of the following formula to obtain the amount of antifungal
agent substance or the volume of diluent needed for a standard solution:
V ×ρ
m = (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
where
ρ is the concentration of the stock solution, in mg/l;
m is mass of the antifungal agent (powder), in g;
P is the potency of the antifungal agent (powder), in mg/g;
V is the volume of diluent, in l.
Concentrations of stock solutions should be 1 000 mg/l or greater, although the solubility of some agents
is a limiting factor. The actual concentrations of stock solutions depend on the method of preparing
working solutions (serial dilutions). Some agents require alternative solvents (see Table 1). Sterilization
of solutions is not usually necessary. If required, sterilization should be done by membrane filtration
and samples before and after sterilization should be compared by assay to ensure that adsorption has
not occurred.
Unless information is available on stability of stock solutions under specified storage conditions, they
should be prepared fresh for each test batch.
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Table 1 — Solvents and diluents for preparation of stock solutions of antifungal agents
Solvent Diluent
Antifungal agent
(Full strength and intermediate solutions)
a
Amphotericin B DMSO Medium
a
Anidulafungin DMSO Medium
a
Caspofungin DMSO Medium
Flucytosine Water Medium
Fluconazole Water or DMSO according to manufacturer’s instructions Medium
a
Itraconazole DMSO Medium
a
Ketoconazole DMSO Medium
a
Micafungin DMSO Medium
a
Posaconazole DMSO Medium
a
Ravuconazole DMSO Medium
a
Voriconazole DMSO Medium
a
DMSO (dimethyl sulfoxide) is potentially toxic.
3.3.3 Preparation of working solutions
The interval of concentrations selected for testing depends on the organisms and antifungal agent. The
chosen range shall allow full end point MIC determination for appropriate reference strains. A twofold
dilution series based on 1 mg/l is prepared in RPMI-1640 glucose broth. The procedure outlined in
Tables 2 and 3 are known to reliably produce a satisfactory dilution series and should be followed unless
an alternative method is carefully validated. For example, the work of one group has reported that serial
[10]
dilutions of the more hydrophilic compounds can produce acceptable results . Working solutions shall
be used the same day unless information is available from the manufacturer on stability of the solutions
under specified storage conditions.
Table 2 — Scheme for preparing dilutions of water-soluble antifungal agents to be used in broth
dilution susceptibility tests
Antifungal solution
Step Concentration Source Volume + Medium = Intermediate = Final Log
2
Concentration Concentration at
1:10
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 5120 Stock 1,0 3,0 1280 128 7
2 5120 Stock 1,0 7,0 640 64 6
3 640 Step 2 1,0 1,0 320 32 5
4 640 Step 2 1,0 3,0 160 16 4
5 160 Step 4 1,0 1,0 80 8 3
6 160 Step 4 0,5 1,5 40 4 2
7 160 Step 4 0,5 3,5 20 2 1
8 20 Step 7 1,0 1,0 10 1 0
9 20 Step 7 0,5 1,5 5 0,5 -1
10 20 Step 7 0,5 3,5 2,5 0,25 -2
11 2.5 Step 10 1,0 1,0 1,25 0,125 -3
12 2.5 Step 10 0,5 1,5 0,625 0,0625 -4
13 2.5 Step 10 0,5 3,5 0,3125 0,03125 -5
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Table 3 — Scheme for preparing dilutions series of water-insoluble antifungal agents to be used
in broth dilution susceptibility tests
Antifungal solution
Step Concentration Source Volume + Solvent = Intermediate = Final concen- Log
2
a
(e.g. DMSO) concentration tration at 1:100
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 1600 Stock  1600 16 4
2 1600 Stock 0,5 0,5 800 8,0 3
3 1600 Stock 0,5 1,5 400 4,0 2
4 1600 Stock 0,5 3,5 200 2,0 1
5 200 Step 4 0,5 0,5 100 1,0 0
6 200 Step 4 0,5 1,5 50 0,5 -1
7 200 Step 4 0,5 3,5 25 0,25 -2
8 25 Step 7 0,5 0,5 12,5 0,125 -3
9 25 Step 7 0,5 1,5 6,25 0,0625 -4
10 25 Step 7 0,5 3,5 3,13 0,0313 -5
a
Dimethyl sulfoxide.
3.3.4 Preparation of broth microdilution trays for tests to be read visually
3.3.4.1 Visual reading pathway
Working solutions are dispensed into 10 wells of each row of microdilution trays at 100 µl per well with
double the desired final concentrations of antifungal agent in 96 well round-bottom disposable plastic trays.
At least one well per row, containing 100 µl of antimicrobial agent-free medium, should be included
as a growth control for each strain tested. Likewise, a well containing 200 µl of antifungal agent-free
medium should be included as an uninoculated negative control well for each strain tested.
3.3.5 Preparation of microdilution trays for tests to be read by spectrophotometer
3.3.5.1 Spectrophotometric reading pathway
Working solutions are dispensed into microdilution trays at 100 µl per well with double the desired final
concentrations of antifungal agent in double strength medium in 96 well flat-bottom disposable plastic trays.
At least one well per row, containing 100 µl of antifungal agent-free medium, should be included as a
growth control for each strain tested. Likewise, a well containing 200 µl of antifungal agent-free medium
should be included as an uninoculated negative control well for each strain tested.
3.4 Storage of microdilution trays
Filled trays may be used immediately or may be stored in sealed plastic bags and immediately placed
in a freezer (CLSI method, visual read: − 70 °C for up to 6 months; EUCAST method, spectrophotometer
read: −70 °C or below for up to 6 months, or at −20 °C for not more than 1 month. Allowable storage
period will be determined based upon drug manufacturer’s instructions for individual compounds and
conformance with acceptable QC ranges. Trays shall not be stored in a self-defrosting freezer and thawed.
Antifungal solutions shall not be refrozen, as repeated freeze–thaw cycles accelerate the degradation of
some antifungal agents.
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3.5 Preparation of inoculum — General
3.5.1 General
Standardization of the inoculum is essential for accurate and reproducible broth dilution susceptibility tests.
All isolates should be subcultured onto a non-inhibitory agar medium to ensure purity and viability.
3.5.2 Preparation of inoculum for visual test reading
The inoculum should be prepared by picking five colonies approximately 1 mm in diameter from 20
(±2) h-old cultures of Candida spp. or 46 (±2) h-old cultures of C. neoformans. The colonies should be
suspended in 5 ml of sterile 0,85 % saline or sterile water. Note that C. neoformans have a slow growth
rate. The optimal growth temperature of C. neoformans is 30 °C.
The resulting suspension should be vortexed for 15 s and the cell density adjusted with a
spectrophotometer by adding sufficient sterile saline or sterile water to achieve an optical density
equivalent to that produced by a 0,5 McFarland standard (see Appendix B) at 530 nm wavelength. This
6 6
procedure will yield a yeast suspension of 10 to 5 × 10 CFU/ml.
Mix the adjusted yeast suspension with a vortex mixer, dilute 1:50 with the appropriate version of RPMI-
1640 broth medium, and further dilute 1:20 with medium to obtain the two times the final test inoculum
3 3
(10 to 5 x 10 CFU/ml). Dilute the (double strength) inoculum 1:1 when the wells are inoculated with
3 3
100 µl of the inoculum that will result in the desired final inoculum size of 0,5 × 10 to 2.5 × 10 CFU/ml.
3.5.3 Preparation of inoculum for spectrophotometric test reading
The inoculum should be prepared by picking five colonies approximately 1 mm in diameter from 18
to 24 h-old cultures of Candida spp. or 46 (±2) h-old cultures of C. neoformans. The colonies should be
suspended in 5 ml of sterile distilled water.
The resulting suspension should be vortexed for 15 s and the cell density adjusted with a
spectrophotometer by adding sufficient sterile saline or sterile water to achieve an optical density
equivalent to that produced by a 0,5 McFarland standard (see Appendix B) at 530 nm wavelength. This
6 6
procedure will yield a yeast suspension of 10 to 5 × 10 CFU/ml.
Mix the adjusted yeast suspension with a vortex mixer, dilute 1:10 with sterile distilled water to obtain
5 5
the double strength the test inoculum (10 to 5 × 10 CFU/ml). Dilute the (double strength) inoculum 1:1
when the wells are inoculated with 100 µl of the inoculum that will result in the desired final inoculum
5 5
size of 0,5 x 10 to 2,5 × 10 CFU/ml.
3.6 Inoculation of microdilution trays
The trays shall be inoculated within 30 min of standardizing the inoculum suspension, in order to
maintain v
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16256
Première édition
2012-12-01
Essais de laboratoire clinique et
systèmes de diagnostic in vitro —
Méthode de référence pour
soumettre à essai l’activité in vitro
des agents antimicrobiens par
rapport aux levures impliquées dans
les maladies infectieuses
Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems —
Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial
agents against yeast fungi involved in infectious diseases
Numéro de référence
ISO 16256:2012(F)
©
ISO 2012

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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Termes et définitions . 1
3 Modes opératoires . 4
3.1 Généralités . 4
3.2 Milieu . 4
3.3 Agents antifongiques . 5
3.4 Stockage des plaques de microdilution . 8
3.5 Préparation de l’inoculum — Généralités . 8
3.6 Inoculation des plaques de microdilution . 9
3.7 Incubation des plaques de microdilution . 9
3.8 Lecture des résultats de CMI .10
3.9 Interprétation des CMI .10
4 Contrôle qualité .10
Annexe A (informative) Milieu RPMI-1640 .13
Annexe B (informative) Étalon de turbidité de 0,5 McFarland au sulfate de baryum .15
Annexe C (informative) Moments de lecture acceptables pour les interprétations de CMI en cas de
lecture visuelle .16
Bibliographie .17
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ISO 16256:2012(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 16256 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d’analyses de biologie
médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
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ISO 16256:2012(F)

Introduction
Les essais de sensibilité in vitro sont réalisés sur des micro-organismes soupçonnés d’être pathogènes;
particulièrement s’ils sont supposés appartenir à des espèces pouvant avoir développé une résistance à
des agents antimicrobiens courants. Ces essais sont également utilisés dans le cadre de la surveillance
de résistance, des études épidémiologiques de sensibilité, ainsi que pour comparer les nouveaux agents
avec ceux existants.
La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des agents antimicrobiens se fait
via des protocoles par dilution qui constituent la méthode de référence pour les essais de sensibilité
aux agents antifongiques. Les méthodes de détermination de CMI servent à surveiller la résistance,
aux essais comparatifs de nouveaux agents à des fins de recherche ou d’enregistrement, à établir la
sensibilité des organismes produisant des résultats ambigus lors d’essais de routine, aux essais sur
les organismes lorsque les essais de routine sont peu fiables et à obtenir des résultats quantitatifs
nécessaires à un traitement clinique. Dans des essais par dilution, on éprouve la capacité des micro-
organismes à se développer de façon discernable sur une série de plaques gélosées (dilution en milieu
solide) ou de bouillons de culture (dilution en milieu liquide) renfermant des dilutions consécutives
d’agents antimicrobiens.
La CMI est définie comme la plus faible concentration d’un agent antimicrobien (en mg/l) qui, dans des
conditions d’essai in vitro données, réduit de façon mesurable visuellement ou optiquement, la croissance
d’un micro-organisme sur une durée donnée. La CMI est un indicateur de la sensibilité de l’organisme
à l’agent antimicrobien et aide à la prise de décision de traitement clinique. Les résultats pouvant
être influencés par la méthode utilisée, un contrôle et une normalisation soigneux sont nécessaires
pour maintenir une reproductibilité intra- et interlaboratoires. Il est généralement reconnu que les
déterminations de CMI en bouillon sont reproductibles jusqu’à une dilution au demi de la concentration
critique (c’est-à-dire à plus ou moins une cupule ou un tube dans une série de dilutions au demi).
La dilution en milieu liquide est une technique dans laquelle des contenants renfermant des volumes
identiques de solutions d’agent antimicrobien aux concentrations croissantes (généralement au-demi)
sont ensemencés d’une quantité connue de microorganismes.
La microdilution en milieu liquide correspond à un essai de dilution en milieu liquide sur une plaque de
microdilution.
Les méthodes de référence décrites dans la présente partie de l’ISO 16256 sont destinées aux essais sur
des cultures pures de levures. Les méthodes de microdilution en milieu liquide décrites dans la présente
partie de l’ISO 16256 sont essentiellement identiques à celles décrites par le Clinical et Laboratory
[1] [2]
Standards Institute (CLSI) et par le Comité européen des antibiogrammes (EUCAST) . Ces méthodes
se sont révélées présenter des CMI du fluconazole globalement, si ce n’est exactement, identiques à 2 mg/l
[3]
près . Des études avec divers autres agents antifongiques sont prévues ou en cours. Il convient que le
laboratoire qui souhaiterait utiliser la présente Norme internationale pour des études sur de nouveaux
agents antifongiques ou pour des comparaisons avec des CMI obtenues par un dispositif diagnostique
choisisse les options du protocole à employer en fonction du mode de lecture de la CMI, selon qu’elle se
fasse par inspection visuelle (méthode CLSI) ou par spectrophotométrie (méthode EUCAST). Quel que
soit son choix, le mode opératoire de l’option choisie doit être scrupuleusement observé.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16256:2012(F)
Essais de laboratoire clinique et systèmes de diagnostic
in vitro — Méthode de référence pour soumettre à essai
l’activité in vitro des agents antimicrobiens par rapport
aux levures impliquées dans les maladies infectieuses
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des
matériaux, opérations et équipements dangereux. La présente Norme internationale ne prétend
pas examiner tous les problèmes de sécurité associés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
de la présente Norme internationale d’établir, avant de l’utiliser, des pratiques d’hygiène et de
sécurité appropriées et de déterminer l’applicabilité des restrictions réglementaires.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode d’essai de la sensibilité aux agents antifongiques
des levures pathogènes, dont Candida spp. et Cryptococcus neoformans. La méthode de référence ici
décrite n’a pas été utilisée dans des études sur les phases levures de champignons dimorphes tels que
B. dermatitidis et ou H. capsulatum variété capsulatum. En outre, les essais sur les champignons filamenteux
(moisissures) posent d’autres problèmes de normalisation qui ne sont pas traités par la présente
procédure. Des méthodes de référence pour les essais de détermination de sensibilité antifongique des
champignons filamenteux par dilution en milieu liquide ont été élaborées et sont maintenant consignées
[4][5][6][7][8]
dans le document M38 du CLSI et le document E.DEF 9.1 de l’EUCAST .
La présente Norme internationale décrit la méthode de référence pour la microdilution en milieu
liquide qui peut être réalisée de deux façons. La première implique une détermination visuelle de la CMI
[1]
(méthode CLSI) ; la seconde implique une détermination spectrophotométrique de la CMI (méthode
[2]
EUCAST) . La CMI reflète l’activité de l’agent antimicrobien dans les conditions d’essai décrites
et peut, avec d’autres facteurs tels que la pharmacologie de l’agent ou les mécanismes de résistance
antifongique, servir dans la prise de décision de traitement clinique. Les CMI permettent de classer les
organismes comme «sensible» (S), «sensible selon la dose» (SFD), «intermédiaire» (I), «non sensible»
(NS) ou «résistant» (R). Par ailleurs, les CMI peuvent servir à définir les populations en types sauvage
ou non sauvage. L’interprétation clinique de la CMI sort du domaine d’application de la présente Norme
internationale. Des critères d’interprétation catégoriels spécifiques aux méthodes du CLSI et de
[2][9]
l’EUCAST sont donnés dans les derniers tableaux d’interprétation édités par ces organismes . Dans
le cadre d’une validation ou d’un enregistrement, il est recommandé de comparer les méthodes d’essai
de sensibilité de routine ou les dispositifs de diagnostic à la présente méthode de référence, afin de
garantir des résultats comparables et fiables.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
agent antifongique
substance d’origine biologique, semi-synthétique ou synthétique qui inhibe la croissance des
champignons ou les tue et peut, par conséquent, servir au traitement des infections
2.2 Agents antifongiques — Propriétés
NOTE Cette définition n’inclut pas les produits désinfectants, antiseptiques et conservateurs.
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2.2.1
teneur
fraction active d’une substance d’essai, déterminée par dosage par rapport à une poudre de référence
de la même substance
NOTE La teneur peut être exprimée par une fraction massique en milligrammes par grammes (mg/g) ou par
un contenu actif en unités internationales (UI) par gramme ou par un pourcentage volumique ou massique ou par
une concentration massique en moles d’ingrédient par litre de la substance d’essai.
2.2.2
concentration
quantité d’agent antifongique dans un volume défini de liquide
NOTE 1 La concentration est exprimée en mg/l.
NOTE 2 mg/l = µg/ml, mais l’emploi de l’unité µg/ml n’est pas recommandé.
2.3
solution mère
solution initiale servant aux dilutions
2.4
concentration minimale inhibitrice
CMI
concentration la plus faible qui, dans des conditions d’essai in vitro données, réduit la croissance dans
une mesure donnée sur une période donnée
NOTE La CMI est exprimée en mg/l.
2.5
concentration critique
CC
valeur précise de la CMI qui permet d’affecter un champignon à l’une des catégories cliniques «sensible»,
«sensible selon la dose», «intermédiaire», «non sensible» et «résistant»
2.5.1 Lecture visuelle
NOTE Pour les concentrations critiques en vigueur, se référer aux dernières publications des organisations
[1][2][9]
employant la méthode de référence (par exemple le CLSI et l’EUCAST) .
2.5.1.1
sensible
S
qualificatif d’une souche fongique inhibée in vitro par une concentration en un agent antifongique, qui
est associée à une forte probabilité de succès thérapeutique
NOTE 1 Les souches fongiques sont classées «sensibles» en considérant la concentration critique appropriée
dans un système d’essais phénotypiques défini.
NOTE 2 Cette concentration critique peut être modifiée dans certaines circonstances (par exemple
modifications des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.5.1.2
sensible selon la dose
S-SD
qualificatif d’une souche fongique inhibée in vitro par une concentration en agent antifongique atteinte in
vivo au moyen de doses d’agent plus élevées que la normale, lorsque ces accroissements de dose restent sûrs
NOTE 1 Les souches fongiques sont classées «sensibles selon la dose» en considérant les concentrations
critiques appropriées dans un système d’essais phénotypiques défini.
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NOTE 2 Cette catégorisation implique qu’une infection due à l’isolat peut être traitée de manière appropriée
dans les sites corporels où les médicaments sont physiologiquement concentrés ou lorsqu’une posologie plus
importante peut être utilisée.
NOTE 3 Cette concentration critique peut être modifiée dans certaines circonstances (par exemple
modifications des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.5.1.3
à sensibilité intermédiaire
I
micro-organisme défini comme intermédiaire par un niveau d’activité d’agent antimicrobien associée à
un effet thérapeutique incertain
NOTE Cela implique qu’une infection due à l’isolat peut être traitée de manière appropriée dans les sites
corporels où les médicaments sont physiologiquement concentrés ou lorsqu’une posologie plus importante peut
être utilisée; il indique également une «zone tampon» empêchant tout facteur technique, incontrôlé, de faible
importance, de provoquer des écarts d’interprétation majeurs.
2.5.1.4
non sensible
NS
qualificatif des levures n’ayant encore été catégorisées que comme sensibles, non connues, dose
dépendantes, intermédiaire ni résistantes (c’est-à-dire uniquement sensibles) et est souvent affecté aux
nouveaux agents antifongiques pour lesquels aucun isolat résistant n’a encore été rencontré
2.5.1.5
résistante
R
qualificatif d’une souche fongique inhibée in vitro par une concentration en agent antifongique, qui est
associée à une forte probabilité d’échec thérapeutique
2.5.2 Lecture spectrophotométrique
NOTE 1 Les souches fongiques sont classées «résistantes» en considérant les concentrations critiques
appropriées dans un système d’essais phénotypiques défini.
NOTE 2 Cette concentration critique peut être modifiée dans certaines circonstances (par exemple modifications
des posologies habituelles des médicaments, émergence de nouveaux mécanismes de résistance).
2.5.2.1
sensible
S
micro-organisme défini comme sensible par un niveau d’activité antimicrobienne associée à une forte
probabilité de succès thérapeutique
2.5.2.2
à sensibilité intermédiaire
I
micro-organisme défini comme intermédiaire par un niveau d’activité d’agent antimicrobien associée à
un effet thérapeutique incertain
NOTE Cela implique qu’une infection due à l’isolat peut être traitée de manière appropriée dans les sites
corporels où les médicaments sont physiologiquement concentrés ou lorsqu’une posologie plus importante peut
être utilisée; il indique également une «zone tampon» empêchant tout facteur technique, incontrôlé, de faible
importance, de provoquer des écarts d’interprétation majeurs.
2.5.2.3
résistant
R
micro-organisme défini comme résistant par un niveau d’activité antimicrobienne associée à une forte
probabilité d’échec thérapeutique
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2.6
type sauvage
absence, chez une souche fongique donnée, de mécanisme acquis de résistance à l’agent antifongique donné
2.7
souche de référence
souche fongique répertoriée, bien connue, aux phénotypes et/ou génotypes de sensibilité antifongique
stables et définis
2.8 Méthode d’essai de sensibilité
NOTE Les souches de référence sont conservées sous forme de cultures mères desquelles sont obtenues des
cultures d’essai. Elles proviennent de collections de cultures et servent au contrôle qualité.
2.8.1
dilution en milieu liquide
technique selon laquelle des conteneurs sont remplis de volumes appropriés d’une solution antifongique
aux concentrations croissantes (souvent d’un facteur de 2) en agent antifongique, puis complétés de
volumes adaptés de bouillon contenant un inoculum défini
NOTE Cette méthode a pour but de déterminer la CMI.
2.8.2
microdilution
réalisation d’une dilution en milieu liquide dans des plaques de microdilution d’une capacité ≤300 µl par
cupule
2.9
bouillon
milieu liquide employé pour cultiver les levures in vitro
2.10
inoculum
nombre de levures dans une suspension, calculé par rapport au volume final
NOTE L’inoculum est exprimé en unités formant colonie par millilitre (UFC/ml).
2.11
effet de l’inoculum
modification de la CMI liée à une modification de l’inoculum
3 Modes opératoires
3.1 Généralités
Les essais sont réalisés dans des plaques de microdilution en plastique jetables. Le protocole consiste
à préparer des solutions d’essai d’agent antifongique doublement concentrées, à raison de 100 µl par
cupule, puis de leur ajouter un inoculum lui aussi de 100 µl.
3.2 Milieu
3.2.1 Généralités
Le milieu à employer est un bouillon RPMI-1640 (voir l’Annexe A pour la préparation des deux versions
du bouillon glucosé RPMI-1640).
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3.2.2 Lecture visuelle
Il convient que le milieu RPMI-1640 contienne 0,2 % de glucose. Le bouillon RPMI-1640 est préparé
simplement concentré, puis mélangé à des dilutions d’agent antifongique doublement concentrées et à la
suspension de levures contenant l’inoculum désiré, le volume de suspension étant égal au volume de bouillon.
3.2.3 Lecture spectrophotométrique
Il convient que le milieu RPMI-1640 contienne 2 % de glucose. Le bouillon RPMI-1640 comme l’agent
antifongique sont tous deux préparés doublement concentrés et l’inoculum est ensuite ajouté dans un
volume égal d’eau distillée.
3.3 Agents antifongiques
3.3.1 Généralités
Les agents antifongiques doivent être obtenus directement auprès de leur fabricant ou de sources
commerciales fiables. Les préparations pharmaceutiques pour usage clinique ne sont pas acceptables.
Les agents antifongiques doivent être fournis avec un numéro de lot, une teneur, une date d’expiration et
des indications sur les conditions de stockage recommandées. Sans consigne particulière du fabricant,
les substances doivent être conservées dans des conteneurs hermétiques, à l’obscurité, à -20 °C, avec un
dessiccatif. Il convient que les agents hygroscopiques soient répartis en aliquotes, dont un est utilisé à
chaque essai.
Afin d’éviter toute condensation et perte de teneur, laisser les conteneurs se réchauffer à température
ambiante avant de les ouvrir.
3.3.2 Préparation des solutions mères
La pesée des agents antifongiques doit se faire au moyen d’une balance analytique étalonnée. En fonction
de la teneur de la poudre, la formule suivante donne la quantité de substance antifongique ou le volume
de diluant nécessaire pour obtenir la solution mère:
V ×ρ
m = (1)
P
mP×
V = (2)
ρ
où
ρ est la concentration de la solution mère, en mg/l;
m est la masse d’agent antifongique (poudre), en g;
P est la teneur en agent antifongique (poudre), en mg/g;
V est le volume de diluant, en l.
Bien que la solubilité de certains agents soit un facteur limitant, il convient que la concentration des
solutions mères soit de 1 000 mg/l. Les concentrations des solutions mères dépendent de la méthode de
préparation des solutions d’essai (dilutions en série). Certains agents réclament des solvants alternatifs
(voir Tableau 1). Généralement, la stérilisation des solutions n’est pas nécessaire. Si elle est nécessaire,
il convient que la stérilisation soit réalisée par filtration sur membrane et que des échantillons avant et
après stérilisation soient comparés pour vérifier qu’aucune adsorption ne se soit produite.
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À moins que des informations sur la stabilité des solutions mères n’indiquent qu’elles puissent être
conservées dans des conditions de stockage précises, il convient que ces solutions soient préparées juste
avant chaque lot d’essais.
Tableau 1 — Solvants et diluants pour la préparation des solutions mères d’agent antifongique
Solvant
Agent antifongique Diluant
(solutions finales et intermédiaires)
a
Amphotéricine B DMSO Milieu
a
Anidulafungine DMSO Milieu
a
Caspofungine DMSO Milieu
Flucytosine Eau Milieu
Fluconazole Eau ou DMSO – suivant les instructions du fabricant Milieu
a
Itraconazole DMSO Milieu
a
Kétoconazole DMSO Milieu
a
Micafungine DMSO Milieu
a
Posaconazole DMSO Milieu
a
Ravuconazole DMSO Milieu
a
Voriconazole DMSO Milieu
a
DMSO = diméthyl-sulfoxyde; Le DMSO est potentiellement toxique.
3.3.3 Préparation des solutions d’essai
L’intervalle de concentrations retenu pour les essais dépend des organismes et de l’agent antifongique. La
plage choisie doit permettre une détermination de la CMI pour les souches de référence correspondantes.
Une série de dilutions au demi est préparée à partir d’une solution mère à 1 mg/l dans un bouillon RPMI-
1640 glucosé. La procédure indiquée dans les Tableaux 2 et 3 est connue pour produire une série de
dilutions fiables et il convient de la suivre tant qu’une méthode alternative n’est pas validée. Par exemple,
le travail d’un groupe a mis en évidence que des dilutions en série des composés les plus hydrophiles
[10]
pouvaient donner des résultats acceptables . À moins que des informations du fabricant sur la stabilité
des solutions n’indiquent qu’elles puissent être conservées dans des conditions de stockage précises, les
solutions d’essai doivent être employées le jour de leur préparation.
Tableau 2 — Plan de préparation des dilutions d’agent antifongique hydrosoluble à employer
dans les essais de sensibilité en milieu liquide
Solution antifongique
Étape Concentration Source Volume + Milieu = Concentration = Concentration Log
2
intermédiaire finale au 1/10
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 5 120 Mère 1,0 3,0 1 280 128 7
2 5 120 Mère 1,0 7,0 640 64 6
3 640 Étape 2 1,0 1,0 320 32 5
4 640 Étape 2 1,0 3,0 160 16 4
5 160 Étape 4 1,0 1,0 80 8 3
6 160 Étape 4 0,5 1,5 40 4 2
7 160 Étape 4 0,5 3,5 20 2 1
8 20 Étape 7 1,0 1,0 10 1 0
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Tableau 2 (suite)
Solution antifongique
Étape Concentration Source Volume + Milieu = Concentration = Concentration Log
2
intermédiaire finale au 1/10
mg/l ml ml mg/l mg/l
9 20 Étape 7 0,5 1,5 5 0,5 -1
10 20 Étape 7 0,5 3,5 2,5 0,25 -2
11 2,5 Étape 10 1,0 1,0 1,25 0,125 -3
12 2,5 Étape 10 0,5 1,5 0,625 0,062 5 -4
13 2,5 Étape 10 0,5 3,5 0,312 5 0,031 25 -5
Tableau 3 — Plan de préparation des dilutions d’agent antifongique non-hydrosoluble à
employer dans les essais de sensibilité en milieu liquide
Solution antifongique
Étape Concentra- Source Volume + Solvant = Concentration = Concentra- Log
2
tion (par ex. intermédiaire tion finale au
a
DMSO) 1/10
mg/l ml ml mg/l mg/l
1 1 600 Mère  1 600 16 4
2 1 600 Mère 0,5 0,5 800 8,0 3
3 1 600 Mère 0,5 1,5 400 4,0 2
4 1 600 Mère 0,5 3,5 200 2,0 1
5 200 Étape 4 0,5 0,5 100 1,0 0
6 200 Étape 4 0,5 1,5 50 0,5 -1
7 200 Étape 4 0,5 3,5 25 0,25 -2
8 25 Étape 7 0,5 0,5 12,5 0,125 -3
9 25 Étape 7 0,5 1,5 6,25 0,062 5 -4
10 25 Étape 7 0,5 3,5 3,13 0,031 3 -5
a
Diméthyl sulfoxide
3.3.4 Préparation de plaques de microdilution pour des essais à lecture visuelle
3.3.4.1 Lecture visuelle
100 µl de solution d’essai sont introduits dans chacune des 10 premières cupules de chaque rang d’une
plaque de microdilution jetable en plastique de 96 cupules à fond arrondi. Cette solution d’essai contient
le double de la concentration finale en agent antifongique.
Sur chaque rangée, il convient de prévoir au moins une cupule contenant 100 µl de milieu sans agent
antifongique comme témoin positif de croissance pour chaque souche soumise à essai. De même, il
convient de prévoir une cupule contenant 200 µl de milieu sans agent antifongique et sans inoculum,
comme témoin négatif pour chaque souche soumise à essai.
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3.3.5 Préparation de plaques de microdilution pour des essais à lecture spectrophotométrique
3.3.5.1 Lecture par spectrophotométrie
100 µl de solution d’essai sont introduits dans chacune des 10 premières cupules de chaque rang d’une
plaque de microdilution jetable en plastique de 96 cupules à fond plat. Cette solution d’essai contient le
double de la concentration finale en agent antifongique.
Sur chaque rangée, il convient de prévoir au moins une cupule contenant 100 µl de milieu sans agent
antifongique comme témoin positif de croissance pour chaque souche soumise à essai. De même, il
convient de prévoir une cupule contenant 200 µl de milieu sans agent antifongique et sans inoculum,
comme témoin négatif pour chaque souche soumise à essai.
3.4 Stockage des plaques de microdilution
Les plaques remplies peuvent être utilisées immédiatement ou stockées dans des sacs plastiques et
placées immédiatement au congélateur (méthode CLSI, lecture visuelle: -70 °C jusqu’à 6 mois; méthode
EUCAST, lecture spectrophotométrique: -70 °C ou moins jusqu’à 6 mois ou à -20 °C pendant 1 mois
maximum). La durée de stockage acceptable est déterminée par les instructions du fabricant de chaque
composé et par le respect des plages acceptables selon l’assurance qualité. Les plaques ne doivent pas
être conservées dans un congélateur auto-dégivrant. Les solutions antifongiques décongelées ne doivent
pas être recongelées, la répétition de cycles de gel-dégel accélérant la dégradation de certains agents
antifongiques.
3
...