ISO 20813:2019

NORME ISO
INTERNATIONALE 20813
Première édition
2019-05
Analyse moléculaire de
biomarqueurs — Méthodes d'analyse
pour la détection et l'identification
des espèces animales dans les
aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur l'utilisation
des acides nucléiques) — Exigences
générales et définitions
Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection
and identification of animal species in foods and food products
(nucleic acid-based methods) — General requirements and definitions
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Caractéristiques de performances des méthodes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Domaine d’application de la méthode . 2
4.3 Base scientifique . 2
4.4 Unités de mesure . 2
4.5 Applicabilité . 3
4.6 Spécificité . 3
4.6.1 Généralités . 3
4.6.2 Exigences pour les essais d’inclusivité . 4
4.6.3 Exigences pour les essais d’exclusivité . 4
4.7 Sensibilité . 4
4.7.1 Généralités . 4
4.7.2 Limite de détection (LOD) . 5
4.8 Exigences spécifiques pour les méthodes quantitatives . 5
4.8.1 Généralités . 5
4.8.2 Limite de quantification (LQ) . 5
4.8.3 Gamme dynamique . 6
4.8.4 Détermination de la fidélité et de la justesse des méthodes quantitatives . 6
4.9 Robustesse . 7
4.9.1 Généralités . 7
4.9.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires . 7
4.9.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel . 7
5 Validation par un seul laboratoire . 7
6 Étude interlaboratoires . 7
6.1 Généralités . 7
6.2 Méthodes qualitatives . 8
6.3 Méthodes quantitatives . 8
7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire . 8
7.1 Généralités . 8
7.2 Installations, matériaux et équipement. 8
7.3 Préparation de l’échantillon et extraction de l’ADN . 9
7.4 Utilisation de témoins .10
7.5 Analyse des données .10
7.5.1 Témoin .10
7.5.2 PCR classique .11
7.5.3 Courbes d’amplification de PCR en temps réel .11
7.6 Expression des résultats .11
7.6.1 Expression des résultats positifs .11
7.6.2 Expression des résultats négatifs .12
7.6.3 Expression des résultats quantitatifs .12
8 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Liste des espèces typiques utilisées pour les essais d’inclusivité et
d’exclusivité .14
Annexe B (informative) Exemples de méthodes de conversion des unités des nombres de
copies d’ADN en rapport de masses .19
Bibliographie .28
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l'analyse moléculaire de biomarqueurs.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20813:2019(F)
Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes
d'analyse pour la détection et l'identification des espèces
animales dans les aliments et les produits alimentaires
(méthodes basées sur l'utilisation des acides nucléiques)
— Exigences générales et définitions
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences minimales concernant les caractéristiques de performances
pour la détection de séquences d’acide nucléique (ADN) par des méthodes moléculaires telles que la
réaction de polymérisation en chaîne (PCR), incluant différentes méthodes de détection post-PCR,
la PCR en temps réel, des techniques de détection basées sur une et/ou plusieurs sondes, ainsi que la
combinaison de ces méthodes.
Le présent document est applicable à la détection, l’identification, la quantification de l’ADN d’espèces
animales appartenant à des groupes taxonomiques supérieurs ou inférieurs dans les produits
alimentaires, ainsi que la validation des méthodes applicables.
Il est applicable aux mammifères, aux oiseaux, aux reptiles, aux amphibiens, aux poissons, aux
mollusques, aux crustacés et aux insectes. Pour chacun d’entre eux, des exemples typiques sont fournis
dans l’Annexe A.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 16577, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Termes et définitions
ISO 24276, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l’ISO 16577, l’ISO 24276, ainsi que les
suivants, s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
basic local alignment search tool
BLAST
algorithme de comparaison de séquences à vitesse optimisée, qui est utilisé pour les recherches dans
les bases de données de séquences, pour des alignements locaux optimaux en réponse à une requête
Note 1 à l'article: Cet algorithme effectue automatiquement une approximation des alignements optimisant une
mesure de similarité locale, le score MST (maximal signal pair) ou le score HSP (high-scoring segment pair).
Note 2 à l'article: Voir Référence [2].
Note 3 à l'article: BLASTn est applicable à la comparaison de séquence nucléotidique.
3.2
réaction de polymérisation en chaîne classique
PCR classique
méthode de PCR nécessitant une étape post-PCR telle que l’électrophorèse sur gel pour la détection ou
la visualisation des produits d’amplification, afin d’obtenir un résultat qualitatif
4 Caractéristiques de performances des méthodes
4.1 Généralités
Les méthodes employées pour l’analyse des espèces animales doivent répondre aux caractéristiques
de performances conformément au présent document. Les résultats de toutes les validations
interlaboratoires et/ou de laboratoire unique et les caractéristiques de performances doivent être
décrits.
NOTE Un certain nombre de lignes directrices sont disponibles pour la mise en œuvre des méthodes,
voir Référence [10].
4.2 Domaine d’application de la méthode
Des informations concernant l’utilisation prévue et les limites des méthodes doivent être fournies.
En particulier, les informations doivent indiquer que les critères définis dans le présent document ont
été satisfaits.
4.3 Base scientifique
Il convient de fournir une vue d’ensemble des principes et références à des publications scientifiques
pertinentes.
4.4 Unités de mesure
Les analyses qualitatives indiquent la présence ou l’absence (non-détection) d’une certaine cible.
Dans les analyses quantitatives, la valeur mesurée est calculée comme le rapport des nombres de copies
d’ADN (c/c). Il convient que l’utilisation de ce rapport examine les influences possibles, y compris le
nombre de copies d’ADN de la cible dans le génome. D’autres unités (par exemple, rapport de masses)
peuvent être employées. Les principes de calcul du rapport doivent être indiqués.
Si une méthode quantitative est destinée à juger le rapport masse/masse d’ingrédients provenant
d’espèces animales différentes dans un échantillon, il convient d’indiquer que les valeurs mesurées
pour le rapport de nombre de copies d’ADN ne peuvent pas refléter dans tous les cas le rapport masse/
masse des constituants animaux dans l’échantillon.
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4.5 Applicabilité
Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode pour un usage donné, il convient de considérer les
aspects suivants concernant la nature de la cible:
— la localisation de la cible (nucléaire ou mitochondriale);
— le nombre de copies par cellule;
— la longueur de la séquence cible.
Pour les méthodes quantitatives spécifiques d’une espèce, un gène nucléaire, en excluant l’ADN
mitochondrial, doit être ciblé. La séquence cible doit être présente sous la forme d’une copie unique par
génome haploïde, ou le nombre de copies doit être déterminé/connu.
Lors de l’évaluation de l’adéquation d’une méthode pour un usage donné, il convient de considérer les
aspects suivants concernant la matrice:
— la nature des matrices d’échantillon potentielles;
— le degré de traitement des constituants de l’échantillon;
— les différentes espèces et les différents types de tissus animaux impliqués;
— la préparation de la matrice d’échantillon.
L’applicabilité de la méthode doit être soumise à essai en extrayant l’ADN d’échantillons pour essai
reflétant les matrices et le domaine d’application de l’analyse.
Il convient d’extraire l’ADN d’un minimum de trois matrices parmi les types les plus pertinents,
incluant les types reflétant le domaine d’application de la méthode, contenant une teneur masse/masse
connue des matériaux de la ou des espèces cibles (uniformément répartis sur la gamme dynamique de
pourcentage de la méthode) et des tissus pertinents pour l’application.
NOTE 1 Les cibles de PCR mitochondriales ne peuvent pas être utilisées pour une quantification fiable des
rapports de nombre de copies de génome haploïde d’espèces différentes, car la quantité de cibles mitochondriales
diffère selon le type de tissu.
NOTE 2 Différents types de tissus animaux peuvent avoir une teneur en ADN variable par équivalent massique.
NOTE 3 La limite de détection (LOD) pratique (voir l’ISO 21569) peut différer significativement pour des
matrices différentes. En outre, différents grades de traitement des constituants animaux dans le même produit
contribueront à la dégradation de l’ADN et à une distribution asymétrique possible de l’ADN entre les ingrédients.
Par exemple, un produit peut être composé de différents types de tissus animaux, contenant différentes quantités
d’ADN. Ce déséquilibre peut en outre être intensifié si certains ingrédients ont subi un prétraitement, comme
une cuisson ou un traitement acide, abaissant la qualité de l’ADN, alors que d’autres ingrédients ont été ajoutés,
par exemple bruts ou traités différemment.
4.6 Spécificité
4.6.1 Généralités
Il convient d’évaluer la spécificité selon un mode opératoire en deux étapes: évaluation théorique et
expérimentale de l’inclusivité et de l’exclusivité.
Des essais in silico de la spécificité des amorces et des sondes doivent être réalisés avec les outils
bioinformatiques disponibles.
NOTE 1 Des exemples sont les essais portant sur la formation de dimères d’amorces avec les recherches au
[1] [2]
moyen de primer3 et de BLAST dans les bases de données de séquences d’acides nucléiques.
Si les données de séquences sont utilisées pour vérifier les résultats de spéciation animale, il convient
d’employer des bases de données appropriées, en tenant compte de manière appropriée du moment de
soumission des entrées individuelles et de toute modification ultérieure de la classification taxonomique
ou de la dénomination.
NOTE 2 En cas de résultats inattendus, des investigations supplémentaires peuvent être menées avec des
techniques appropriées telles que le séquençage, l’électrophorèse sur gel ou l’hybridation, pour confirmer
l’identité du matériau de référence.
4.6.2 Exigences pour les essais d’inclusivité
Il convient de fournir les résultats expérimentaux des essais de la méthode avec les espèces animales
cibles. Il convient que ces essais incluent des races pertinentes des espèces animales, selon le domaine
d’application de la méthode (voir 4.2).
Il convient que le matériau employé pour les essais d’inclusivité contienne environ 100 copies
[6]
d’ADN cible . Chaque matériau échantillon doit être soumis à essai en double au minimal. Il convient
de détecter les variants de séquence des espèces animales cibles avec une efficacité d’amplification
comparable, le cas échéant.
NOTE Les espèces animales cibles pour les essais d’inclusivité appartiennent normalement à plus de
cinq races.
4.6.3 Exigences pour les essais d’exclusivité
Les résultats expérimentaux fournis par les essais de la méthode avec des espèces animales non cibles
doivent être fournis. Il convient que ces essais incluent à la fois des espèces animales étroitement et non
étroitement liées sur le plan taxonomique. Des espèces animales ou groupes taxonomiques pertinents
au vu du champ d’application de la méthode doivent être soumis à essai, par exemple des espèces
couramment employées dans les aliments en général et en particulier dans les matrices considérées
dans le champ d’application de la méthode. Il convient que la méthode fasse clairement la distinction
entre les espèces animales cibles et non cibles.
Il convient d’utiliser une quantité suffisante d’ADN pour les essais d’exclusivité expérimentale. Un
[6]
nombre de 2 500 copies cibles garantit que la réactivité croisée peut être identifiée.
Sélectionner un minimum de 10 espèces qui pourraient causer des interférences avec les espèces
animales cibles présentes dans le matériau pour essai. Des exemples d’organismes adaptés sont donnés
à l’Annexe A.
Il convient d’inclure d’autres espèces si elles sont pertinentes, par exemple en cas d’homologies de
séquences d’oligonucléotides avec les séquences d’acides nucléiques.
Il convient de caractériser la réactivité croisée de la matrice.
Il convient de confirmer l’adéquation de l’ADN employé pour l’amplification en utilisant un témoin
d’amplification, par exemple un système de PCR consensus avec ADN (chromosomique) monocopie (par
exemple, myostatine ou actine).
4.7 Sensibilité
4.7.1 Généralités
Les résultats expérimentaux obtenus avec la méthode à différentes concentrations pour évaluer la
plage d’utilisation de la méthode doivent être disponibles. Ils doivent être décrits dans le rapport de
validation.
S’il y a lieu, il convient de fournir des informations détaillées sur la manière dont une valeur seuil peut
être établie et utilisée dans le laboratoire.
Il convient de détecter aux niveaux pertinents pour la partie intéressée, par exemple le consommateur,
les espèces animales nécessitant un essai qualitatif.
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4.7.2 Limite de détection (LOD)
4.7.2.1 LOD absolue
La LOD absolue (LOD ) doit être indiquée en nombre de copies de la séquence cible par réaction et le
abs
niveau de confiance (généralement 95 %) doit être précisé.
NOTE 1 Vingt copies ou moins peuvent être appliquées pour les gènes monocopie et un nombre approprié
d’équivalents génome haploïde pour les gènes à nombre élevé de copies.
NOTE 2 Si, pour la détermination de la LOD, un ADN avec un nombre connu de copies de la séquence cible n’est
pas disponible, un ADN plasmidique peut être employé.
La LOD de la méthode est déterminée expérimentalement en préparant une série de dilutions du
abs
matériau cible avec des dilutions comprises dans la plage de limite de détection attendue/cible. Des
recommandations pour l’évaluation de la LOD sont fournies dans la Référence [6].
abs
4.7.2.2 LOD relative
La LOD relative (LOD ) doit être déterminée dans l’ADN d’espèces animales non cibles pertinentes
rel
comme référence. Selon les exigences de l’essai, la LOD est ajustée à cette valeur. La LOD exprime
rel rel
le % c/c relatif de l’ADN de l’espèce animale cible dans l’ADN d’autres espèces animales, avec une
confiance de 95 %.
Il convient de déterminer la LOD expérimentalement en préparant un ou plusieurs échantillons de
rel
référence définis contenant un pourcentage défini de l’ADN cible dans la plage de limite de détection.
Chaque échantillon de référence est analysé en au moins 10 réplicats. Le pourcentage de l’échantillon de
référence pour lequel au moins 95 % des réplicats donnent des résultats positifs est considéré comme
la LOD .
rel
4.7.2.3 LOD asymétrique (pour les méthodes multiplex uniquement)
Dans le cas des méthodes multiplex où la détection des différentes cibles est limitée par des effets
compétitifs, comme dans le cas des méthodes de PCR en temps réel multiplex, la LOD des cibles uniques
dans une situation d’asymétrie de cibles exprimée en rapport de cible doit être validée. Différentes
teneurs en séquence cible animale spécifique sont mélangées pour obtenir des rapports de copies
définis (c’est-à-dire rapports de 1/1 000 et 1 000/1; 1/100 et 100/1). Le rapport dans lequel chaque
animal cible est détecté avec une confiance de 95 % est déterminé expérimentalement avec un nombre
approprié de réplicats pour l’échantillon de référence défini.
4.8 Exigences spécifiques pour les méthodes quantitatives
4.8.1 Généralités
La limite supérieure et inférieure de la gamme linéaire de la méthode doit être déterminée. L’évaluation
de ces limites et de la gamme linéaire doit être réalisée sur des échantillons contenant de l’ADN non
cible animal pertinent pour l’aliment.
4.8.2 Limite de quantification (LQ)
La LOQ absolue (LOQ ) doit être indiquée sous la forme de nombres de copies de la séquence cible. Elle
abs
doit être égale à la plus faible quantité incluse dans la gamme dynamique.
La LOQ relative (LOQ ) doit être déterminée dans l’ADN d’autres espèces animales pertinentes. Selon
rel
les exigences de l’essai, il convient d’ajuster la LOQ à cette valeur. La LOQ exprime le rapport entre
rel rel
le nombre de copies d’ADN de l’espèce animale cible et de copies d’ADN d’autres espèces animales
ou copies d’ADN d’un gène de référence représentatif du rang taxonomique complet. Il convient que
la LOQ soit égale à la plus faible concentration incluse dans la gamme dynamique.
rel
Si, pour la détermination de la LOQ, un ADN avec un nombre connu de copies de la séquence cible n’est
pas disponible, il convient d’utiliser un ADN plasmidique. Ce plasmide peut également servir d’étalon.
Un minimum de 15 réplicats avec une concentration cible de la LOQ attendue doit être soumis à essai.
Les critères de fidélité et de justesse doivent être remplis pour les résultats.
NOTE Les valeurs de LOQ fournies par l’étude interlaboratoires font généralement référence au plus faible
niveau d’analyte observé ayant un écart-type de reproductibilité relatif de 25 % ou moins.
4.8.3 Gamme dynamique
Il convient que la gamme dynamique couvre les valeurs de pourcentage ainsi que les nombres de copies
conformément à l’utilisation attendue et au domaine d’application de la méthode.
Afin de définir le nombre de copies minimal pertinent, la gamme dynamique désirée en termes de
pourcentages de copies cibles doit être déterminée. Il convient de considérer que la taille du génome des
espèces dans le matériau échantillon attendu limite le nombre maximal de copies pouvant être utilisé
pour l’analyse (par exemple de 100 ng à 200 ng, selon la méthode).
NOTE 1 Par exemple, pour les bovins, une taille de génome de 4 pg peut être supposée, ce qui conduit à un
[18][22]
nombre maximal de copies de 25 000 dans 100 ng de matériau ADN échantillon. Voir Tableau B.2 .
Les nombres de copies de la gamme dynamique à la fois pour la séquence cible et de référence doivent
ensuite être déterminés de la manière suivante:
— pour la séquence de référence, le nombre maximal de copies peut être calculé en tenant compte des
tailles de génome et de la quantité d’ADN échantillon utilisé pour l’analyse comme décrit ci-dessus;
— pour la cible, il convient que le plus petit nombre de copies soit la LOQ absolue; à titre de
prérequis, il convient de prendre en compte la plus faible valeur possible en considérant le rapport
comparativement au nombre maximal de copies d’ADN total/de référence;
— il convient de fournir le nombre minimal de copies de la séquence de référence et le nombre maximal
de copies de la séquence cible, par le rapport de la valeur de pourcentage minimale et maximale,
respectivement.
NOTE 2 La gamme dynamique est établie sur la base d’une courbe standard, avec un minimum de
quatre niveaux de concentration répartis uniformément au moins en double.
NOTE 3 Pour une limite supérieure souhaitée de la gamme dynamique de 100 %, le nombre minimal de copies
de la référence peut être égal à la limite inférieure de la plage de nombre de copies de la séquence cible, et pour
une LOQ souhaitée de 0,1 % à une LOQ absolue de 30 copies, la limite supérieure de la cible de référence est
de 30 000 copies.
4.8.4 Détermination de la fidélité et de la justesse des méthodes quantitatives
Il convient de déterminer et d'exprimer la fidélité comme l’écart-type de répétabilité relatif (S ).
r
Il convient d’analyser un nombre suffisant de réplicats (au moins 15) pour au moins 3 matériaux d’ADN
avec différents pourcentages cibles, couvrant toute la gamme dynamique.
NOTE L’ADN mitochondrial ne peut pas être utilisé pour les cibles des méthodes quantitatives.
Le S de tous les réplicats doit être ≤ 25 % sur toute la gamme dynamique de la méthode.
r
La justesse doit être comprise dans les 25 % de la valeur de référence acceptée pour tous les réplicats
sur toute la gamme dynamique de la méthode.
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4.9 Robustesse
4.9.1 Généralités
Il convient de fournir les résultats de l’essai empirique de la méthode avec des variations faibles mais
délibérées des paramètres de la méthode (par exemple, variation de concentration des composants de
la trousse, variation de l’appareillage) s’ils sont disponibles.
4.9.2 Détermination de la robustesse par une étude interlaboratoires
Une étude interlaboratoires introduit un changement délibéré dans le laboratoire réalisant la méthode
et atteint les critères pour une évaluation de la robustesse. Empiriquement, une méthode robuste doit
être sélectionnée en considérant que les résultats de différents laboratoires ne varient pas de façon
significative.
4.9.3 Détermination de la robustesse par un essai orthogonal multifactoriel
Il convient que l’essai soit réalisé selon une approche multifactorielle, dans laquelle plusieurs altérations
incluant, sans s’y limiter, la concentration du mélange maître, le volume réactionnel, la concentration de
l’amorce et de la sonde, la température d’hybridation et la plateforme du thermocycleur, sont évaluées.
NOTE 1 Un mode opératoire détaillé est décrit dans la Référence [6].
Pour les méthodes qualitatives, il convient de soumettre à essai au moins trois réplicats. Il convient que
le nombre de copies de l’espèce animale cible employé dans l’essai soit présent dans une concentration
trois fois supérieure à la LOD (confiance à 95 %) de la méthode.
abs
Pour les méthodes quantitatives, il convient de soumettre à essai trois concentrations cibles définies
sur toute la gamme dynamique de la méthode dans trois réplicats chacune.
NOTE 2 La méthode est considérée comme robuste si toutes les réactions donnent les résultats attendus.
5 Validation par un seul laboratoire
Il convient qu’une méthode d’analyse ait été suffisamment soumise à essai au sein d’un laboratoire pour
fournir les spécifications requises avant l’étude interlaboratoires, voir l’ISO 13495.
Il convient de considérer l’emploi de matériaux de référence ou de matériaux de référence certifies (MRC)
pour la validation des méthodes de détection et de quantification des acides nucléiques.
6 Étude interlaboratoires
6.1 Généralités
Les informations concernant l’étude interlaboratoires (organisateur, protocole, nombre de laboratoires
participants, etc.) et les données de performances obtenues par l’étude doivent être déclarées avec
les références appropriées des documents pertinents. Les études collaboratives pour la validation
des méthodes de PCR pour la détection, l’identification et la quantification de séquences d’ADN
spécifiques peuvent être réalisées conformément à d’autres documents pertinents (par exemple, Codex
[7]
Alimentarius CAC/GL 74-2010 ).
NOTE Une étude collaborative à petite échelle (étude de prévalidation impliquant, par exemple, de 2
à 4 laboratoires) peut être réalisée pour soumettre à essai la transférabilité générale de la méthode avant
l’organisation d’une étude à grande échelle.
Pour une validation de la précision des méthodes de détection et d'identification, les données sont
recueillies à partir de nombreux laboratoires disposant des installations et des compétences requises
pour les essais de biologie moléculaire. Dans l’ISO 13495:2013, les nombres requis de laboratoires
sont de respectivement huit et quatre pour le niveau international et national de validation. Selon
[23]
AOAC International (2002) , le nombre requis est de huit laboratoires. Les analyses statistiques sont
calculées sur la base de l’ISO 5725-1:1994, 6.3.
6.2 Méthodes qualitatives
Une étude collaborative de validation d’une méthode de PCR qualitative doit être conçue en considérant
la probabilité de détection (POD) (voir l’ISO/TS 16393) au sein de la gamme de la méthode.
NOTE Les taux traditionnels non paramétriques de 5 % de faux positifs et de 5 % de faux négatifs reflètent
des POD de 5 % et de 95 %.
6.3 Méthodes quantitatives
Il convient que l’écart-type de reproductibilité relatif (S ) soit ≤ 25 % sur toute la gamme dynamique de
R
la méthode.
NOTE Aux niveaux de 0,1 % (copie/copie), un S de 50 % peut être acceptable.
R
7 Exigences générales du laboratoire et du mode opératoire
7.1 Généralités
Le mode opératoire doit être documenté, de manière à inclure les éléments suivants:
— représentativité de l’échantillon;
— préparation de l’échantillon pour essai (facultatif: si l’échantillon pour essai n’est pas l’échantillon
entier pour laboratoire, homogénéiser l’échantillon pour laboratoire et obtenir des échantillons
pour essai conformément aux normes internationales pertinentes);
— broyage et homogénéisation de l’échantillon pour essai;
— préparation des prises d’essai;
— extraction de l’ADN;
— essai, interprétation et communication des résultats.
Les recommandations de sécurité des fabricants doivent être respectées.
7.2 Installations, matériaux et équipement
Il convient de concevoir la zone de travail dans le laboratoire de manière à empêcher une contamination
accidentelle de l’ADN à partir, par exemple, de poussière, de matériau humain et d’aérosols; les éléments
à envisager sont notamment les suivants:
— le confinement systématique des étapes méthodologiques intervenant dans la production des
résultats;
— le respect du principe de marche en avant pour la manipulation des échantillons.
Pour les méthodes basées sur l’ADN, une séparation (temporelle et/ou physique) du travail est
nécessaire pour éviter la contamination. La conception de zones de travail contenues/dédiées avec leur
propre appareillage est recommandée, comme suit:
a) une zone de travail pour le broyage et l’homogénéisation;
b) une zone de travail pour l’extraction des acides nucléiques du matériau d’essai;
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c) une zone de travail réservée à la mise en place des réactions PCR/d’amplification;
d) une zone de travail réservée au traitement ultérieur, notamment l’analyse et la caractérisation des
séquences d’ADN amplifiées, s’il y a lieu.
Si de l’ADN humain est détecté par la méthode, il convient de prendre des mesures appropriées de
prévention de la contamination (par exemple, utilisation de masques, de gants et blouses jetables) pour
éviter les résultats faussement positifs dus à la contamination par l’ADN de l’opérateur ou d’un autre
humain durant l’analyse.
L’utilisation de plusieurs pièces est la plus efficace et la meilleure façon de séparer les zones de travail,
mais d’autres méthodes peuvent être utilisées comme protection contre la contamination dans la
mesure où leur efficacité est comparable. Il convient de configurer et de diriger le système de flux
d’air de manière à empêcher l’intrusion de poussière/amplicons des zones de travail à risque élevé de
contamination vers les zones de travail à risque plus faible.
Sauf indication contraire, il convient d’utiliser uniquement au cours de l’analyse des réactifs de
grade analytique, adaptés à la biologie moléculaire et exempts d’ADN ou de désoxyribonucléase.
Sauf indication contraire, il convient de stocker les réactifs et les solutions à température ambiante.
Il convient de conserver les réactifs pour PCR en petites aliquotes afin de réduire le plus possible les
risques de contamination. L’eau utilisée doit être double-distillée, désionisée ou de qualité comparable.
Sauf indication contraire, il convient que les solutions soient préparées en dissolvant les réactifs
appropriés dans de l’eau et en les passant à l’autoclave. Des dispositifs de filtration stérile (par exemple,
de 0,22 µm de taille de pores) peuvent être utilisés lorsque l’autoclavage n’est pas possible.
Afin d’éviter la contamination, il convient d’adopter une technique stérile dans la zone de mise en place
de la PCR, par exemple l’utilisation de gants non poudrés, de vaisselle en plastique stérilisée, de réactifs
passés à l’autoclave, de vaisselle en plastique jetable et d’embouts de pipettes avec filtre protégés des
aérosols, sans ADN/ARN et sans DNase/RNase.
Les matériaux et tous les récipients et équipements jetables contenant des réactifs doivent être protégés
de tout agent contaminant (par exemple, la poussière).
Il convient de suivre les recommandations des fabricants concernant l’emploi des réactifs. Des témoins
appropriés peuvent être utilisés pour évaluer l’intégrité des réactifs et l’absence de DNase.
Aucune activité enzymatique non intentionnelle (par exemple, exonucléase) susceptible d’interférer
avec la PCR ne doit être présente dans la préparation. Le tampon de réaction doit être adapté à la
polymérase utilisée.
7.3 Préparation de l’échantillon et extraction de l’ADN
Il convient de soumettre à essai un échantillon représentatif. Il doit être garanti que les échantillons
pour essai utilisés pour l’extraction de l’ADN sont représentatifs de l’échantillon pour laboratoire,
par exemple par homogénéisation de l’échantillon ou de portions appropriées de l’échantillon. Il
convient de prélever au moins deux aliquotes de l’échantillon de laboratoire homogénéisé comme prises
d’essai pour l’extraction de l’ADN et l’analyse.
Si possible, il convient de ne pas prélever le matériau échantillon de la surface de l’échantillon pour
laboratoire, afin de réduire au minimum le risque d’amplification des contaminants adhérents.
Si la méthode d’analyse utilisée pour l’échantillon détecte l’ADN humain, il convient de prendre des
mesures spéciales de prévention de la contamination.
En ce qui concerne la préparation d’ADN provenant de la prise d’essai, il convient de suivre les
instructions générales et les mesures décrites dans l’ISO 21571. Il convient d’envisager l’une des
méthodes d’extraction de l’ADN décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe A. Des trousses commerciales
peuvent aussi être utilisées pour l’extraction et la purification de l’ADN.
7.4 Utilisation de témoins
Il convient d’exécuter des témoins conformément au Tableau 1 (voir aussi l’ISO 24276).
Il convient de préparer un témoin négatif d’ADN cible à partir d’ADN extrait d’espèces non cibles
prévalentes dans l’échantillon (par exemple, pour la recherche de cheval dans une viande bovine,
l’espèce non cible est le bovin).
Tableau 1 — Schéma montrant l'intersection des étapes et l'inclusion des témoins
Étape témoin Témoin Témoin Témoin posi- Témoin Témoin négatif Témoin Témoin d’inhibi-
f h
d’environ- négatif tif d’extrac- positif d’ADN d’ADN cible de réactif tion de PCR
b c d e g
nement d’extraction tion cible pour PCR
Homogénéisation Recommandée — — — — — —
Obligatoire
Extraction de
a
↓ Une par série à intervalles — — — —
l’acide nucléique
réguliers
Évaluation de la
qualité de l’acide ↓ ↓ ↓ — — — —
nucléique
Recommandée,
Amplification de
↓ ↓ ↓ Obligatoire Recommandée Obligatoire mais obligatoire
l’acide nucléique
i
dans certains cas
Évaluation des
résultats de
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
l’amplification de
l’acide nucléique
Interprétation — ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
Rapport d’essai — ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
a
Les flèches indiquent qu’il convient d’appliquer ce témoin dans les étapes d’analyse ultérieures.
b
L’utilisation de témoins d’environnement aide le laboratoire à identifier les sources de contamination à un stade précoce et peut permettre d’identifier
dans quelle zone de travail la contamination est présente. Cela peut être démontré de diverses manières, par exemple si des échantillons négatifs inclus dans
la série d’échantillons homogénéisés ont montré des résultats négatifs, en démarrant à la première étape du processus (par exemple, étape de broyage si elle
est pertinente).
c
Au moins un témoin négatif d’extraction doit être inclus à chaque fois que de l’ADN est extrait d’un ou plusieurs échantillons. Le tube doit toujours être
le dernier dans chaque série. Il peut être approprié de placer un témoin négatif d’extraction, par exemple, sur un portoir de huit tubes ou une microplaque de
96 puits pour extraction automatisée.
d
Un témoin positif d’extraction doit être inclus régulièrement. Ce témoin révélera une éventuelle anomalie concernant les réactifs ou la mise en œuvre
du protocole d’extraction.
e
Le témoin positif d’ADN cible démontre la capacité du mode opératoire d’amplification de l’acide nucléique à détecter la séquence d’ADN cible à un
faible nombre de copies, pour confirmer la LOD.
f
Le témoin négatif d’ADN cible démontre la capacité du mode opératoire d’am
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