ISO 14183:2005
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of monensin, narasin and salinomycin contents — Liquid chromatographic method using post-column derivatization
Animal feeding stuffs — Determination of monensin, narasin and salinomycin contents — Liquid chromatographic method using post-column derivatization
ISO 14183:2005 specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the determination of the monensin, narasin and salinomycin contents of animal feeding stuffs, supplements (dry and liquid) and mineral premixtures. The method is not applicable to drug premixes (pharmaceutical products). Lasalocid and semduramicin cannot be determined by this method. The limit of quantitation is approximately 1 mg/kg, 2 mg/kg and 2 mg/kg for monensin, salinomycin and narasin, respectively. A lower limit of quantitation can be achievable but this is to be validated by the user.
Aliments des animaux — Détermination des teneurs en monensine, narasine et salinomycine — Méthode par chromatographie liquide utilisant la dérivatisation post-colonne
L'ISO 14183:2005 spécifie une méthode de détermination des teneurs en monensine, en narasine et en salinomycine dans les aliments pour animaux, les compléments (secs et liquides) et les prémélanges de minéraux, par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). La méthode ne s'applique pas aux prémélanges médicamenteux (produits pharmaceutiques) et ne permet pas de déterminer le lasalocide et la semduramicine. La limite de quantification est respectivement d'environ 1 mg/kg, 2 mg/kg et 2 mg/kg pour la monensine, la salinomycine et la narasine. Une limite de quantification inférieure peut être atteinte mais cela est sujet à validation par l'utilisateur.
General Information
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 14183
First edition
2005-11-01
Animal feeding stuffs — Determination of
monensin, narasin and salinomycin
contents — Liquid chromatographic
method using post-column derivatization
Aliments des animaux — Détermination des teneurs en monensine,
narasine et salinomycine — Méthode par chromatographie liquide
utilisant la dérivatisation post-colonne
Reference number
©
ISO 2005
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Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 1
5 Apparatus . 4
6 Sampling. 5
7 Preparation of test sample. 5
8 Procedure . 6
8.1 Preparation of quality control sample . 6
8.2 Extraction . 6
8.3 HPLC analysis . 7
8.4 Determination. 8
9 HPLC confirmation . 9
9.1 General. 9
9.2 Post-column derivatization with DMAB. 9
9.3 Hexane extraction. 10
10 Calculation of results . 10
10.1 General. 10
10.2 Monensin . 10
10.3 Salinomycin. 11
10.4 Narasin. 12
10.5 Interpretation of confirmation data. 13
11 Precision. 14
11.1 Interlaboratory test . 14
11.2 Repeatability. 14
11.3 Reproducibility. 14
11.4 Limit of quantitation . 15
12 Test report . 15
Annex A (informative) Results of interlaboratory test. 16
Bibliography . 21
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 14183 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 14183:2005(E)
Animal feeding stuffs — Determination of monensin, narasin
and salinomycin contents — Liquid chromatographic method
using post-column derivatization
1 Scope
This International Standard specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method for the
determination of the monensin, narasin and salinomycin contents of animal feeding stuffs, supplements (dry
and liquid) and mineral premixtures. The method is not applicable to drug premixes (pharmaceutical products).
Lasalocid and semduramicin cannot be determined by this method.
The limit of quantitation is approximately 1 mg/kg, 2 mg/kg and 2 mg/kg for monensin, salinomycin and
narasin, respectively. A lower limit of quantitation can be achievable but this is to be validated by the user.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6498:1998, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples
3 Principle
The ionophores monensin, narasin and salinomycin are extracted using methanol/water (90 + 10) with
mechanical shaking for 1 h, then the extracts are filtered. The ionophores are determined by reverse-phase
HPLC using post-column derivatization with vanillin and detection at 520 nm. Suspect positive trace-level
samples and medicated feed samples containing unexpected ionophores are confirmed using a hexane
extraction or post-column derivatization with dimethylaminobenzaldehyde (DMAB).
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
4.1 Water, HPLC grade, or equivalent (e.g. Milli-Q purified water).
4.2 Methanol (CH OH), HPLC grade.
4.3 Sulfuric acid (H SO ), 97 % to 98 %.
2 4
4.4 Acetic acid (CH CH CO H), glacial, 97 % to 98 %.
2 3 2
4.5 Sodium hydrogen carbonate (NaHCO ), minimum 99 % purity.
4.6 Vanillin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde), minimum 99 % purity.
4.7 Dimethylaminobenzaldehyde (DMAB), minimum 99 % purity.
4.8 Hexane [CH (CH ) CH ], distilled in glass.
3 2 4 3
4.9 Extraction solvent, methanol/water (90 + 10).
Combine 1 800 ml of methanol (4.2) and 200 ml of water (4.1) in a 2 l flask. Mix well.
4.10 Mobile phases
4.10.1 Post-column reaction system
While stirring gently, slowly add by pipette 20 ml of sulfuric acid (4.3) to 950 ml of methanol (4.2). Allow to cool,
then add 30 g of vanillin (4.6) while stirring. Protect from light. Prepare fresh daily.
4.10.2 HPLC column
Use methanol (4.2)/water (4.1)/acetic acid (4.4) (940/60/1). Filter under vacuum using the equipment in 5.7.
4.11 Neutralized methanol
Add 1,0 g of sodium hydrogen carbonate (4.5) into 4 l of methanol (4.2). Mix well and filter if necessary
1)
through an 11 µm filter paper (e.g. Whatman No. 1) . See Note to 4.13.
4.12 Reference standards
Composition or potency is required for each lot of reference standard.
2)
4.12.1 Monensin sodium
2)
4.12.2 Narasin
3)
4.12.3 Sodium salinomycin
WARNING — Avoid inhalation of and exposure to the toxic standard materials and solutions thereof.
Work in a fume-hood when handling the solvents and solutions. Wear safety glasses and protective
clothing.
4.13 Ionophore stock standards, ca. 0,50 mg/ml.
Accurately weigh, to the nearest 0,1 mg, 25 mg of each standard (4.12.1 to 4.12.3) into separate 50 ml
volumetric flasks. Dissolve in neutralized methanol (4.11) and dilute to volume. Prepare freshly every month.
Store in a refrigerator.
Protect all standard solutions from light or prepare them in low actinic flasks.
NOTE The requirement for neutralized methanol has not been verified for salinomycin. It is not required if analysing
monensin only, but is required for analysis of narasin.
1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users
of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Available from Lilly Research Laboratories, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana 46285, USA.
3) Available from Alpharma Inc., Animal Health Division, 1 Duggar Drive, Willow Island, WV, USA 26134-97111, and
Hoechst Roussel Vet, D-65926 Frankfurt am Main, Gebaude H 790, Germany.
2 © ISO 2005 – All rights reserved
4.13.1 Monensin stock standard
Prepare as described in 4.13. Calculate the concentration of stock standard based on the principle component,
[4]
monensin A. The minor component, monensin B, which elutes just before monensin A is determined in test
samples based on monensin A. Use the component composition identified on the reference standard profile
sheet:
0,5 S
M
ρ =
M
where
0,5 is the concentration of the stock standard (4.13), in milligrams per millilitre, recorded to three
significant figures;
ρ is the concentration of the given component monensin A in the stock standard, in milligrams per
M
millilitre;
S is the proportion of the given component monensin A in the reference standard according to the
M
profile sheet, in percent.
EXAMPLE Reference standard lot RS0234 contains 93,71 % of monensin A on an “as-is” basis.
4.13.2 Salinomycin stock standard
Prepare as described in 4.13. Determine the concentration using the reference standard concentration value
[2]
provided by the supplier :
0,5 w
ρ =
S
where
ρ is the concentration of salinomycin in the stock standard, in milligrams per millilitre;
S
w is the concentration of the salinomycin standard given by the supplier, in micrograms per milligram.
EXAMPLE For lot WS-19B, the standard concentration is 986 µg/mg.
4.13.3 Narasin stock standard
Prepare as described in 4.13. Calculate the concentration of the stock standard based on the principle
[5]
component, narasin A. The minor components (narasin D and l), which elute after narasin A , are
determined in test samples based on narasin A. Use the component composition identified on the reference
standard profile sheet:
0,5 S
N
ρ =
N
where
ρ is the concentration of the component narasin A in the stock standard, in milligrams per millilitre;
N
S is
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14183
Première édition
2005-11-01
Aliments des animaux — Détermination
des teneurs en monensine, narasine et
salinomycine — Méthode par
chromatographie liquide utilisant la
dérivatisation post-colonne
Animal feeding stuffs — Determination of monensin, narasin and
salinomycin contents — Liquid chromatographic method using post-
column derivatization
Numéro de référence
©
ISO 2005
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Web www.iso.org
Version française parue en 2008
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Principe.1
4 Réactifs .1
5 Appareillage .5
6 Échantillonnage .6
7 Préparation de l’échantillon pour essai .6
8 Mode opératoire.6
8.1 Préparation de l’échantillon de contrôle qualité .6
8.2 Extraction .6
8.3 Analyse CLHP .7
8.4 Détermination.9
9 Confirmation CLHP.10
9.1 Généralités .10
9.2 Dérivation post-colonne à l’aide de DMAB .10
9.3 Extraction à l’hexane.10
10 Calculs des résultats.10
10.1 Généralités .10
10.2 Monensine .11
10.3 Salinomycine.12
10.4 Narasine.12
10.5 Interprétation des données de confirmation .14
11 Fidélité .14
11.1 Essai interlaboratoires .14
11.2 Répétabilité.15
11.3 Reproductibilité.15
11.4 Limite de quantification .16
12 Rapport d’essai.16
Annexe A (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .17
Bibliographie .22
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 14183 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 14183:2005(F)
Aliments des animaux — Détermination des teneurs en
monensine, narasine et salinomycine — Méthode par
chromatographie liquide utilisant la dérivatisation post-colonne
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination des teneurs en monensine, en
narasine et en salinomycine dans les aliments pour animaux, les compléments (secs et liquides) et les
prémélanges de minéraux, par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). La méthode ne
s’applique pas aux prémélanges médicamenteux (produits pharmaceutiques) et ne permet pas de déterminer
le lasalocide et la semduramicine.
La limite de quantification est respectivement d’environ 1 mg/kg, 2 mg/kg et 2 mg/kg pour la monensine, la
salinomycine et la narasine. Une limite de quantification inférieure peut être atteinte mais cela est sujet à
validation par l’utilisateur.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6498:1998, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai
3 Principe
Les ionophores monensine, narasine et salinomycine sont extraits à l’aide d’un mélange méthanol/eau
(90 + 10) par agitation mécanique pendant 1 h, puis les extraits sont filtrés. Les ionophores sont déterminés
par CLHP en phase inverse utilisant la dérivation post-colonne à l’aide de vanilline et détection à 520 nm. Les
échantillons supérieurs à la limite de détection ainsi que les échantillons d'aliments médicamenteux contenant
des ionophores inattendus suspects sont confirmés par une extraction à l’hexane ou par une dérivation post-
colonne avec du diméthylaminobenzaldéhyde (DMAB).
4 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
4.1 Eau, qualité CLHP ou équivalente (par exemple eau purifiée Milli-Q).
4.2 Méthanol (CH OH), qualité CLHP.
4.3 Acide sulfurique (H SO ), de 97 % à 98 %.
2 4
4.4 Acide acétique (CH CH CO H), glacial, de 97 % à 98 %.
2 3 2
4.5 Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO ), pureté d’au moins 99 %.
4.6 Vanilline (4-hydroxy-3-méthoxybenzaldéhyde), pureté d’au moins 99 %.
4.7 Diméthylaminobenzaldéhyde (DMAB), pureté d’au moins 99 %.
4.8 Hexane [CH (CH ) CH ], distillé sur verre.
3 2 4 3
4.9 Solvant d'extraction, méthanol/eau (90 + 10).
Mélanger 1 800 ml de méthanol (4.2) et 200 ml d’eau (4.1) dans une fiole de 2 l. Bien mélanger.
4.10 Phases mobiles
4.10.1 Système de réaction post-colonne
Tout en remuant doucement, ajouter lentement à l’aide d’une pipette 20 ml d’acide sulfurique (4.3) à 950 ml
de méthanol (4.2). Laisser refroidir, puis ajouter 30 g de vanilline (4.6) tout en remuant. Mettre à l'abri de la
lumière. Renouveler chaque jour.
4.10.2 Colonne CLHP
Utiliser du méthanol (4.2)/de l’eau (4.1)/de l’acide acétique (4.4) (940/60/1). Filtrer sous vide à l’aide de
l’équipement indiqué en 5.7.
4.11 Méthanol neutralisé
Ajouter 1,0 g d’hydrogénocarbonate de sodium (4.5) dans 4 l de méthanol (4.2). Bien mélanger et filtrer si
1)
nécessaire à l’aide d’un papier filtre de 11 µm (par exemple Whatman N° 1) . Voir la Note en 4.13.
4.12 Étalons de référence
Le titre ou la composition est requis pour chaque lot d’étalons de référence.
2)
4.12.1 Monensine sodium
2)
4.12.2 Narasine
3)
4.12.3 Sodium salinomycine
AVERTISSEMENT — Éviter toute inhalation et exposition aux substances étalons toxiques et leurs
solutions. Travailler sous une hotte aspirante lors de la manipulation des solvants et des solutions.
Porter des lunettes et des vêtements de protection.
4.13 Solutions mères étalons de ionophore, environ 0,50 mg/ml.
Peser exactement, à 0,1 mg près, 25 mg de chaque étalon (4.12.1 à 4.12.3) dans des fioles jaugées séparées
de 50 ml. Dissoudre dans du méthanol neutralisé (4.11) et diluer au volume. Les renouveler tous les mois.
Stocker au frais.
1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de
la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
2) Disponible auprès des laboratoires Lilly Research, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana 46285, États-Unis.
3) Disponible auprès de la société Alpharma Inc., Animal Health Division, 1 Duggar Drive, Willow Island, WV, États-
Unis 26134-97111, et Hoechst Roussel Vet, D-65926 Frankfurt am Main, Gebaude H 790, Allemagne.
2 © ISO 2005 – Tous droits réservés
Protéger toutes les solutions étalons de la lumière ou les préparer dans des fioles qui arrêtent les rayons
actiniques.
NOTE L’exigence relative au méthanol neutralisé n’a pas été vérifiée pour la salinomycine. Elle n’est pas requise s’il
s’agit uniquement d’une analyse de monensine mais elle est requise pour l’analyse de narasine.
4.13.1 Solution mère étalon de monensine
Préparer comme décrit en 4.13. Calculer la concentration de la solution mère étalon basée sur le composant
[4]
principal, monensine A. Le composant secondaire, monensine B, élué juste avant la monensine A est
déterminé dans les échantillons pour essai basés sur la monensine A. Utiliser la composition du composant
identifiée sur la feuille de profil de l’étalon de référence:
0,5 S
M
ρ =
M
où
0,5 est la concentration de la solution mère étalon (4.13), en milligrammes par millilitre, consignée à trois
chiffres significatifs;
ρ est la concentration du composant donné de monensine A dans la solution mère étalon, en
M
milligrammes par millilitre;
S est la proportion du composant donné
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.