ISO/TS 6579-2:2012
(Main)Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
ISO/TS 6579-2 gives a method for the enumeration of Salmonella spp. present in: products intended for human consumption and for the feeding of animals; environmental samples in the area of food production and food handling; animal faeces; and environmental samples from the primary production stage by calculation of the most probable number (MPN). The method is based on miniaturization of the dilution, pre-enrichment and selective enrichment steps. The selective enrichment medium, modified semi-solid Rappaport?Vassiliadis (MSRV), is intended for the detection of motile salmonellae and is not appropriate for the detection of non-motile salmonellae. It is possible that the method is less appropriate to enumerate Salmonella ser. Typhi and Salmonella ser. Paratyphi. The method is not appropriate for the enumeration of Salmonella spp. in (very) low contaminated samples (
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des salmonella — Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le plus probable
L'ISO/TS 6579-2:2012 fournit une méthode de dénombrement de Salmonella spp. présentes dans: les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale; les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits alimentaires; les matières fécales des animaux; les échantillons environnementaux au stade de la production primaire; par le calcul du nombre le plus probable (NPP). La méthode est fondée sur une miniaturisation des étapes de dilution, de préenrichissement et d'enrichissement sélectif. Le milieu d'enrichissement sélectif, le milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV), est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n'est pas adapté à la recherche des Salmonella immobiles. Il est possible que la méthode soit moins appropriée au dénombrement de Salmonella ser. Typhi et Salmonella ser. Paratyphi. La méthode n'est pas appropriée au dénombrement de Salmonella spp. présentes en (très) faibles concentrations dans des échantillons contaminés (
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 6579-2
First edition
2012-11-01
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for the detection,
enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 2:
Enumeration by a miniaturized most
probable number technique
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des Salmonella —
Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le
plus probable
Reference number
©
ISO 2012
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ii © ISO 2012 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium . 2
4.3 Enrichment on a selective semi-solid medium . 2
4.4 Selective plating and identification . 2
4.5 Confirmation . 2
4.6 Calculation of most probable number . 3
5 Culture media and sera . 3
5.1 General . 3
5.2 Culture media . 3
6 Apparatus and glassware . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure . 4
9.1 Test portion, initial suspension . 4
9.2 Dilution and pre-enrichment in non-selective liquid medium . 5
9.3 Selective enrichment on a semi-solid medium . 5
9.4 Selective plating . 5
9.5 Biochemical and serological confirmation . 6
10 Expression of results . 8
11 Test report . 8
Annex A (informative) Composition and preparation of culture media and reagents . 9
Annex B (informative) Diagram of procedure .17
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a technical
committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee
casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a further
three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is confirmed,
it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an International
Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 6579-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
ISO 6579 consists of the following part, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella:
— Part 2: Enumeration·by·a·miniaturized·most·probable·number·technique [Technical Specification]
Additional parts, dealing with a detection method and guidance for serotyping are planned. ISO 6579:2002 is
to be withdrawn at a later date.
iv © ISO 2012 – All rights reserved
Introduction
The procedure described is based on the method reported in Reference [1].
The enumeration procedure described here concerns a miniaturized most probable number (MPN) technique.
For this mini-MSRV (modified semi-solid Rappaport–Vassiliadis) MPN technique, the volume of primary
dilution tested is less than the volume in the detection method specified in ISO 6579:2002 + Cor.1:2004 +
[5]
Amd.1:2007. For this reason, the sensitivity of the mini-MSRV technique is lower than in these detection
methods (Reference [1]). The detection limit of the mini-MSRV method is approximately 1 cfu/g, but can vary
according to Salmonella serovar and per matrix. For the previously mentioned detection methods, this is typically
1 cfu/25 g (0,04 cfu/g). For samples with (very) low numbers of Salmonella spp. (<1 cfu/g), it is possible that
the mini-MSRV procedure is not sufficiently sensitive. If a quantitative result is requested for samples likely to
contain such low numbers (and tested negative with this mini-MSRV technique, for example), it is advisable to
enumerate with a “conventional” MPN technique (not miniaturized). For other samples, the mini-MSRV method
can have an advantage over the conventional MPN technique because the performance of the miniaturized
MPN technique can take less time and need fewer resources (due to small amounts).
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 6579-2:2012(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
the detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 2:
Enumeration by a miniaturized most probable number technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for detecting Sal-
monella, are only undertaken in properly equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and
that great care is taken in the disposal of all incubated materials.
Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory practice. This standard does
not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user
to establish appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national regulatory condi-
tions.
1 Scope
This part of ISO 6579 gives a method for the enumeration of Salmonella spp. present in:
— products intended for human consumption and for the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling;
— animal faeces;
— environmental samples from the primary production stage;
by calculation of the most probable number (MPN).
The method is based on miniaturization of the dilution, pre-enrichment and selective enrichment steps. The
selective enrichment medium, modified semi-solid Rappaport–Vassiliadis (MSRV), is intended for the detection
of motile salmonellae and is not appropriate for the detection of non-motile salmonellae.
It is possible that the method is less appropriate to enumerate Salmonella ser. Typhi and Salmonella ser. Paratyphi.
The method is not appropriate for the enumeration of Salmonella spp. in (very) low contaminated samples (<1 cfu/g).
NOTE The number of non-motile salmonellae is generally low in most of the matrices relevant for this method. In
this note, examples are given for samples from primary production. The non-motile Salmonella biovars of Salmonella
Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar gallinarum and Salmonella Gallinarum biovar pullorum) do not seem to survive
long in environmental samples and are therefore rarely detected in faecal or environmental (such as dust) samples
(regardless of the method). The number of other non-motile Salmonella serovars in faecal samples seems to be generally
low. For example, in Reference [4] in which approximately 1 000 faecal samples of poultry layer flocks and approximately
900 faecal samples of broiler flocks were analysed, less than 1 % of the total number of samples were positive in a
selective broth and at the same time negative on MSRV medium (and likely to be non-motile). Similar results were found
in a Dutch study with ca 3 200 faecal samples of pigs (unpublished data). On the other hand, in the case of the study
reported in Reference [4], up to almost 40 % of positive samples would not have been detected (i.e. false negatives) if only
a selective broth (in this case Rappaport–Vassiliadis) had been used instead of a semi-solid medium.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of
culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Salmonella
microorganism which forms typical or less typical colonies on solid selective media and which displays specific
biochemical and serological characteristics
NOTE Suitable tests for the specific biochemical and serologica
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 6579-2
Première édition
2012-11-01
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des
Salmonella —
Partie 2:
Dénombrement par une technique
miniaturisée du nombre le plus probable
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the
detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
Numéro de référence
©
ISO 2012
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préenrichissement en milieu liquide non sélectif . 2
4.3 Enrichissement en milieu semi-solide sélectif . 2
4.4 Isolement sélectif et identification . 3
4.5 Confirmation . 3
4.6 Calcul du NPP . 3
5 Milieux de culture et sérums . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Milieux de culture . 3
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire . 5
9.1 Prise d’essai et suspension mère . 5
9.2 Dilution et préenrichissement en milieu liquide non sélectif . 5
9.3 Enrichissement sélectif en milieu semi-solide . 5
9.4 Isolement sélectif . 6
9.5 Confirmation biochimique et sérologique . 6
10 Expression des résultats . 8
11 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Composition et préparation de milieux de culture et de réactifs .10
Annexe B (informative) Schéma du mode opératoire .17
Bibliographie .18
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans un
groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des membres
votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS ou ISO/TS
a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa transformation en
Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 6579-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L’ISO 6579 comprend la partie suivante, présentée sous le titre général Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella:
— Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le plus probable [Spécification technique]
Des parties supplémentaires, traitant d’une méthode de détection et donnant des lignes directrices pour la
sérotypie, sont prévues. L’ISO 6579:2002 sera annulée ultérieurement.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
Introduction
Le mode opératoire décrit est fondé sur la méthode donnée en Référence [1].
Le mode opératoire de dénombrement décrit ici se rapporte à une technique miniaturisée du nombre le plus
probable (NPP). Pour cette technique miniaturisée du NPP sur milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis
modifié (MSRV), le volume de la première dilution soumise à essai est inférieur au volume employé dans la
[6]
méthode de détection spécifiée dans l’ISO 6579:2002 + Cor.1:2004 + Amd.1:2007 . Pour cette raison, la
sensibilité de la technique sur MSRV miniaturisé est inférieure à celle obtenue pour ces méthodes de détection
(Référence [1]). La limite de détection de la méthode sur MSRV miniaturisé est d’environ 1 ufc/g, mais peut
fluctuer d’un sérovar de Salmonella à un autre et d’une matrice à une autre. Pour les méthodes de détection
susmentionnées, la limite de détection est habituellement de 1 ufc/25 g (0,04 ufc/g). Pour les échantillons
ne comptant qu’un (très) petit nombre de Salmonella spp. (< 1 ufc/g), le mode opératoire en milieu MRSV
miniaturisé peut ne pas être suffisamment sensible. Si un résultat quantitatif est attendu pour des échantillons
susceptibles de contenir de si faibles nombres de Salmonella spp. (et testés négatifs par cette technique sur
MSRV miniaturisé, par exemple), il est conseillé de procéder au dénombrement à l’aide d’une technique du
NPP «classique» (non miniaturisée). Pour les autres échantillons, la méthode sur MSRV miniaturisé peut être
avantageuse par rapport à la technique du NPP classique du fait que la technique miniaturisée du NPP peut
prendre moins de temps et nécessite moins de ressources (en raison de faibles quantités).
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 6579-2:2012(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella —
Partie 2:
Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le
plus probable
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel d’effectuer
les essais de recherche de Salmonella uniquement dans des laboratoires correctement équipés, sous
la direction d’un microbiologiste compétent, et de faire très attention à l’élimination de toutes les
substances incubées.
Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien les pratiques courantes
de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de
sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques
appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité à la réglementation
nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 6579 décrit une méthode de dénombrement de Salmonella spp. présentes dans:
— les produits destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation animale;
— les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits
alimentaires;
— les matières fécales des animaux;
— les échantillons environnementaux au stade de la production primaire;
par le calcul du nombre le plus probable (NPP).
La méthode est fondée sur une miniaturisation des étapes de dilution, de préenrichissement et d’enrichissement
sélectif. Le milieu d’enrichissement sélectif, le milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV), est
conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n’est pas adapté à la recherche des Salmonella immobiles.
Il est possible que la méthode soit moins appropriée au dénombrement de Salmonella ser. Typhi et Salmonella
ser. Paratyphi.
La méthode n’est pas appropriée au dénombrement de Salmonella spp. présentes en (très) faibles concentrations
dans des échantillons contaminés (< 1 ufc/g).
NOTE Le nombre de Salmonella immobiles est généralement faible dans la plupart des matrices pertinentes pour la
présente méthode. Dans la présente note, des exemples sont donnés pour des échantillons provenant d’une production
primaire. Il semble que les biovars de Salmonella immobiles, les Salmonella Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar
gallinarum et Salmonella Gallinarum biovar pullorum), ne survivent pas longtemps dans les échantillons environnementaux,
ils sont par conséquent rarement détectés dans les échantillons de fèces ou environnementaux (poussière, par
exemple) et cela quelle que soit la méthode. Il semble que le nombre des autres sérovars de Salmonella immobiles
soit généralement faible dans les échantillons de fèces. Par exemple, en Référence [4], environ 1 000 échantillons de
fèces de poules pondeuses et environ 900 échantillons de fèces de poulets de chair ont été analysés, moins de 1 % du
nombre total d’échantillons étaient positifs en bouillon de culture sélectif et négatifs en milieu MSRV (donc susceptibles
d’être immobiles). Une étude hollandaise menée sur environ 3 200 échantillons de fèces de porcs a fourni des résultats
similaires (données non publiées). D’autre part, dans l’étude décrite en Référence [4], pratiquement 40 % des échantillons
positifs n’auraient pas été détectés («faux négatifs») si un bouillon de culture sélectif avait uniquement été utilisé (dans ce
cas, le bouillon Rappaport-Vassiliadis) à la place d’un milieu semi-solide.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables à l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventue
...
Questions, Comments and Discussion
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