ISO/TS 6579-2:2012
(Main)Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
ISO/TS 6579-2 gives a method for the enumeration of Salmonella spp. present in: products intended for human consumption and for the feeding of animals; environmental samples in the area of food production and food handling; animal faeces; and environmental samples from the primary production stage by calculation of the most probable number (MPN). The method is based on miniaturization of the dilution, pre-enrichment and selective enrichment steps. The selective enrichment medium, modified semi-solid Rappaport?Vassiliadis (MSRV), is intended for the detection of motile salmonellae and is not appropriate for the detection of non-motile salmonellae. It is possible that the method is less appropriate to enumerate Salmonella ser. Typhi and Salmonella ser. Paratyphi. The method is not appropriate for the enumeration of Salmonella spp. in (very) low contaminated samples (
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des salmonella — Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le plus probable
L'ISO/TS 6579-2:2012 fournit une méthode de dénombrement de Salmonella spp. présentes dans: les produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale; les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits alimentaires; les matières fécales des animaux; les échantillons environnementaux au stade de la production primaire; par le calcul du nombre le plus probable (NPP). La méthode est fondée sur une miniaturisation des étapes de dilution, de préenrichissement et d'enrichissement sélectif. Le milieu d'enrichissement sélectif, le milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV), est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n'est pas adapté à la recherche des Salmonella immobiles. Il est possible que la méthode soit moins appropriée au dénombrement de Salmonella ser. Typhi et Salmonella ser. Paratyphi. La méthode n'est pas appropriée au dénombrement de Salmonella spp. présentes en (très) faibles concentrations dans des échantillons contaminés (
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 6579-2
First edition
2012-11-01
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for the detection,
enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 2:
Enumeration by a miniaturized most
probable number technique
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des Salmonella —
Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le
plus probable
Reference number
ISO/TS 6579-2:2012(E)
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ISO 2012
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium . 2
4.3 Enrichment on a selective semi-solid medium . 2
4.4 Selective plating and identification . 2
4.5 Confirmation . 2
4.6 Calculation of most probable number . 3
5 Culture media and sera . 3
5.1 General . 3
5.2 Culture media . 3
6 Apparatus and glassware . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure . 4
9.1 Test portion, initial suspension . 4
9.2 Dilution and pre-enrichment in non-selective liquid medium . 5
9.3 Selective enrichment on a semi-solid medium . 5
9.4 Selective plating . 5
9.5 Biochemical and serological confirmation . 6
10 Expression of results . 8
11 Test report . 8
Annex A (informative) Composition and preparation of culture media and reagents . 9
Annex B (informative) Diagram of procedure .17
Bibliography .18
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a technical
committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee
casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a further
three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is confirmed,
it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an International
Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 6579-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
ISO 6579 consists of the following part, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella:
— Part 2: Enumeration·by·a·miniaturized·most·probable·number·technique [Technical Specification]
Additional parts, dealing with a detection method and guidance for serotyping are planned. ISO 6579:2002 is
to be withdrawn at a later date.
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
Introduction
The procedure described is based on the method reported in Reference [1].
The enumeration procedure described here concerns a miniaturized most probable number (MPN) technique.
For this mini-MSRV (modified semi-solid Rappaport–Vassiliadis) MPN technique, the volume of primary
dilution tested is less than the volume in the detection method specified in ISO 6579:2002 + Cor.1:2004 +
[5]
Amd.1:2007. For this reason, the sensitivity of the mini-MSRV technique is lower than in these detection
methods (Reference [1]). The detection limit of the mini-MSRV method is approximately 1 cfu/g, but can vary
according to Salmonella serovar and per matrix. For the previously mentioned detection methods, this is typically
1 cfu/25 g (0,04 cfu/g). For samples with (very) low numbers of Salmonella spp. (<1 cfu/g), it is possible that
the mini-MSRV procedure is not sufficiently sensitive. If a quantitative result is requested for samples likely to
contain such low numbers (and tested negative with this mini-MSRV technique, for example), it is advisable to
enumerate with a “conventional” MPN technique (not miniaturized). For other samples, the mini-MSRV method
can have an advantage over the conventional MPN technique because the performance of the miniaturized
MPN technique can take less time and need fewer resources (due to small amounts).
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 6579-2:2012(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
the detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 2:
Enumeration by a miniaturized most probable number technique
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for detecting Sal-
monella, are only undertaken in properly equipped laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and
that great care is taken in the disposal of all incubated materials.
Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory practice. This standard does
not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user
to establish appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national regulatory condi-
tions.
1 Scope
This part of ISO 6579 gives a method for the enumeration of Salmonella spp. present in:
— products intended for human consumption and for the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling;
— animal faeces;
— environmental samples from the primary production stage;
by calculation of the most probable number (MPN).
The method is based on miniaturization of the dilution, pre-enrichment and selective enrichment steps. The
selective enrichment medium, modified semi-solid Rappaport–Vassiliadis (MSRV), is intended for the detection
of motile salmonellae and is not appropriate for the detection of non-motile salmonellae.
It is possible that the method is less appropriate to enumerate Salmonella ser. Typhi and Salmonella ser. Paratyphi.
The method is not appropriate for the enumeration of Salmonella spp. in (very) low contaminated samples (<1 cfu/g).
NOTE The number of non-motile salmonellae is generally low in most of the matrices relevant for this method. In
this note, examples are given for samples from primary production. The non-motile Salmonella biovars of Salmonella
Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar gallinarum and Salmonella Gallinarum biovar pullorum) do not seem to survive
long in environmental samples and are therefore rarely detected in faecal or environmental (such as dust) samples
(regardless of the method). The number of other non-motile Salmonella serovars in faecal samples seems to be generally
low. For example, in Reference [4] in which approximately 1 000 faecal samples of poultry layer flocks and approximately
900 faecal samples of broiler flocks were analysed, less than 1 % of the total number of samples were positive in a
selective broth and at the same time negative on MSRV medium (and likely to be non-motile). Similar results were found
in a Dutch study with ca 3 200 faecal samples of pigs (unpublished data). On the other hand, in the case of the study
reported in Reference [4], up to almost 40 % of positive samples would not have been detected (i.e. false negatives) if only
a selective broth (in this case Rappaport–Vassiliadis) had been used instead of a semi-solid medium.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production of
culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory
ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Salmonella
microorganism which forms typical or less typical colonies on solid selective media and which displays specific
biochemical and serological characteristics
NOTE Suitable tests for the specific biochemical and serological characteristics are specified in this part of ISO 6579.
3.2
count of Salmonella
number of Salmonella spp. found per millilitre or per gram of a test sample or per surface area or on an object
(e.g. bootsocks)
4 Principle
4.1 General
The enumeration of Salmonella spp. in the MPN format necessitates four successive stages (4.2 to 4.5).
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
-1
Preparation of a 10 dilution of the sample in buffered peptone water (BPW) (initial suspension).
Addition of the initial suspension to the first (empty) row of three wells of a 12-well microtiter plate.
Inoculation of the second row of three wells containing non-selective pre-enrichment broth (BPW) with a
specified quantity, from the first row in a 12-well microtiter plate.
Inoculation of the third, fourth and if necessary more rows of three wells containing BPW.
Incubation of the 12-well microtiter plates at 37 °C for 18 h.
4.3 Enrichment on a selective semi-solid medium
Subculturing of each well obtained in 4.2 in a well containing a semi-solid agar (MSRV).
Incubation at 41,5 °C (MSRV) for 24 h. If MSRV is negative after 24 h, the plate is incubated for a further 24 h.
4.4 Selective plating and identification
From the (suspect) cultures (the highest dilutions) obtained in 4.3, a selective solid medium xylose–lysine–
deoxycholate (XLD) agar is inoculated and incubated at 37 °C for 24 h.
4.5 Confirmation
Colonies of presumptive Salmonella obtained in 4.4 are confirmed by means of appropriate biochemical and
serological tests.
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
4.6 Calculation of most probable number
From the number of confirmed positive wells, the MPN of Salmonella spp. per millilitre or per gram of the test
sample is calculated.
5 Culture media and sera
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218.
For the performance testing of media, follow the recommendations of ISO/TS 11133-1, ISO/TS 11133-2 and
the information as given in A.8.
All media and reagents needed are described in Annex A. Alternatively, dehydrated complete media or diluents
can be used. In the latter case, follow the manufacturer’s instructions.
5.2 Culture media
5.2.1 Non-selective pre-enrichment medium: Buffered peptone water (BPW). See A.1.
5.2.2 Semi-solid selective enrichment agar: Modified semi-solid Rappaport–Vassiliadis medium
(MSRV). See A.2.
5.2.3 Xylose–lysine–deoxycholate (XLD) agar. See A.3.
5.2.4 Nutrient agar. See A.4.
5.2.5 Triple sugar–iron agar (TSI agar). See A.5.
As an alternative, a double sugar–iron agar (Kligler–Hajna) may be used.
5.2.6 Urea agar (Christensen). See A.6.
5.2.7 l-Lysine decarboxylation medium (LDC). See A.7.
5.2.8 Antisera. Several types of agglutinating sera containing antibodies for one or several O-antigens and
for one or several H-antigens are commercially available.
Every attempt should be made to ensure that the anti-sera used are adequate to provide for the detection of
all Salmonella serotypes.
6 Apparatus and glassware
Disposable supplies are an acceptable alternative to reusable glassware if it has similar specifications.
Usual microbiological laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave). See ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or ventilated oven, capable of being maintained at between 25 °C and 50 °C or a
laminar air flow cabinet.
6.3 Incubators, capable of operating at 37 °C ± 1 °C and 41,5 °C ± 1 °C.
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
6.4 Water bath, capable of operating at 47 °C to 50 °C.
6.5 Refrigerator (for storage of prepared media), capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.6 pH-meter, having a resolution of 0,01 pH and accurate to within ± 0,1 pH units at 25 °C. See ISO 7218.
6.7 Sterile test tubes and flasks, of appropriate capacity. Flasks or bottles and test tubes with non-toxic
metallic or plastic (screw) caps may be used.
6.8 Sterile loops of 1 µl.
6.9 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml (with 0,5 ml division),
2 ml (with 0,1 ml division), 0,1 ml (with 0,01 ml division). Multi-channel pipettes of 0,5 ml and 0,02 ml nominal
capacity for pipetting three wells at a time.
6.10 Sterile Petri dishes, of approximately 90 mm diameter.
6.11 Sterile 12-well microtiter plates with wells of approximately 25 mm diameter and 20 mm deep (5 ml)
with a flat bottom with lid.
6.12 Homogenizer. See ISO 7218.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 6579. See the specific International Standard
dealing with the product concerned.
It is important that the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or changed
during transport or storage.
If there is no specific International Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended
that the parties concerned come to an agreement on the subject.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the product concerned.
If there is no specific International Standard, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on the subject.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension
See ISO 6887 and any specific International Standard appropriate to the product concerned. Prepare an initial
suspension by diluting the test portion 10-fold in BPW (5.2.1). For example, add 25 g of sample to 225 ml of
BPW and homogenize, e.g. in a stomacher (6.12), for 1 min.
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
9.2 Dilution and pre-enrichment in non-selective liquid medium
Take a 12-well microtiter plate (6.11) with empty wells in the first row of three wells and containing 2 ml BPW
(5.2.1) in the other wells (second, third and fourth row with each 3 wells; see Annex B).
NOTE 1 As a general case, the described procedure specifies dilutions for one 12-well microtiter plate. When a higher
number than 500 cfu/g of Salmonella is suspected, it is necessary to proceed with a second 12-well microtitre plate
containing 2 ml BPW (5.2.1) in each well. Prepare a sufficient number of plates (dilutions) to ensure that the final well in the
12-well microtiter plate yields a negative result.
Transfer to each well of the first (empty) row of three wells, using a pipette (6.9), 2,5 ml of the initial suspension (9.1).
Transfer 0,5 ml (e.g. by using a multi-channel pipette; 6.9) of each well from the first row into the 2 ml BPW in
-1
the successive wells in the second row (first 5 dilution).
Transfer 0,5 ml (e.g. by using a multi-channel pipette; 6.9, with new tips) of each well from the second row into
-1
the 2 ml BPW in the successive wells in the third row (second 5 dilution).
Before transferring the 0,5 ml of the second row into the third row, mix the suspensions in the wells by repeatedly
(carefully) sucking up and blowing out of the suspension in the pipette and in the wells.
Proceed in the same way for the other rows.
Incubate the 12-well microtiter plate at 37 °C (6.3) for 18 h ± 2 h.
NOTE 2 As the contamination level of the tested samples is generally unknown and often low, it can prove worthwhile to
check for the presence of Salmonella spp. in the sample by also culturing the initial suspension. For this purpose, incubate
(6.3) the initial suspension (9.1) at 37 °C for 18 h± 2 h. For the next culture steps, follow the procedures as described in
9.3 to 9.5. In 9.3: inoculate a Petri dish containing MSRV with 1–3 equally spaced spots with a total volume of 0,1 ml of the
incubated BPW culture of the initial suspension (9.1).
9.3 Selective enrichment on a semi-solid medium
Allow the MSRV (5.2.2) in the 12-well microtiter plates to equilibrate at room temperature if they were stored at
a lower temperature.
Inoculate each well containing 2 ml MSRV with 20 µl of the BPW culture (9.2), e.g. using a multi-channel pipette
(6.9). Use new tips for each row of three wells.
Place the 20 µl BPW culture at the margin of the well and on the surface of the medium (see Annex B).
When taking a subculture from BPW, try not to disturb particulate samples. Therefore, move the microtitre
plates carefully. Avoid pipetting particulate matter on to the MSRV plates.
Incubate the inoculated MSRV plates at 41,5 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Do not invert the plates.
Suspect wells show a grey-white, turbid zone extending out from the inoculated drop. The turbid zone is
characterized by a white halo with a clearly defined edge.
If the wells are negative after 24 h, reincubate for a further 24 h ± 3 h.
9.4 Selective plating
Allow the XLD agar (5.2.3) plates to equilibrate at room temperature if they were stored at lower temperature.
If necessary, dry the surface of the plates before use.
Subculture suspect MSRV wells (9.3) by dipping a 1 µl loop (6.8) just inside the border of the opaque growth
and by inoculating this culture material on the surface of one normal size XLD plate, so that well-isolated
colonies are obtained.
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ISO/TS 6579-2:2012(E)
Subculture at least the highest dilutions: the ones which still show three suspect MSRV wells as well as the
subsequent dilutions showing two or one suspect MSRV wells.
Incubate the inverted XLD plates at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Return negative MSRV plates to the 41,5 °C incubator and incubate for a further 24 h ± 3 h. Perform the
selective plating procedure if after 48 h of incubation additional wells become suspect.
Typical colonies of Salmonella spp. grown on XLD agar have a black centre and a lightly transparent zone of
reddish colour due to the colour change of the indicator.
NOTE Hydrogen sulfide-negative variants of Salmonella spp. grown on XLD agar are pink with a darker pink centre.
Lactose-positive variants of Salmonella spp. grown on XLD agar are yellow with or without blackening.
9.5 Biochemical and serological confirmation
9.5.1 General
Perform confirmation on at least one well-isolated suspect colony from each XLD plate (9.4). If no well-isolated
colony can be obtained, it may be necessary to perform an extra culture step on XLD agar or on a non-
selective agar, e.g. nutrient agar (5.2.4), to obtain well-isolated colonies.
If all wells selected fail to confirm as Salmonella spp., presumptive MSRV wells not already subcultured (in
lower dilutions) should be checked.
If shown to be reliable, commercially available identification kits for the biochemical examination of Salmonella
spp. can be used. The use of identification kits concerns the biochemical confirmation of colonies. These kits
should be used following the manufacturer’s instructions.
NOTE The recognition of colonies of Salmonella spp. is to a large extent a matter of experience, and their appearance
can vary somewhat, not only from serovar to serovar, but also from batch to batch of the selective culture medium used.
9.5.2 Selection of colonies for confirmation
For confirmation, take from each XLD plate (9.4) at least one colony considered to be typical or suspect.
If well-isolated colonies (of a pure culture) are available on the selective plating media (9.4), the biochemical
confirmation can be performed directly on a suspect, well-isolated colony from the selective plating medium.
The culture step on the non-selective agar medium, like nutrient agar (5.2.4) can then be performed in parallel
with the biochemical tests for purity check of the colony taken from the selective agar medium. Incubate
inoculated nutrient agar plates at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Use pure cultures for biochemical and serological confirmation.
9.5.3 Biochemical confirmation
9.5.3.1 General
By means of an inoculating wire, inoculate the media specified in 9.5.3.2, 9.5.3.3 and 9.5.3.4 with each of the
cultures obtained from the colonies selected in 9.5.2.
9.5.3.2 TSI agar (5.2.5)
Streak the agar slant surface and stab the butt. Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Interpret the changes in the medium as follows.
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yellow glucose positive (glucose used)
red or unchanged glucose negative (glucose not used)
Butt
black formation of hydrogen sulfide
bubbles or cracks gas formation from glucose
yellow lactose and/or sucrose positive (lactose and/or sucrose used)
Slant surface
red or unchanged lactose and sucrose negative (neither lactose nor sucrose used)
Typical cultures of Salmonella spp. show alkaline (red) slant and acid (yellow) butts with gas formation (bubbles)
and (in about 90 % of the cases) formation of hydrogen sulfide (blackening of the agar) see Table 1.
A lactose-positive variant of Salmonella spp. gives a yellow slant on TSI. Thus, preliminary confirmation of
Salmonella cultures shall not be based on the results of the TSI agar test only.
9.5.3.3 Urea agar (5.2.6)
Streak the agar slant surface. Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h and examine at intervals.
If the reaction is positive, decomposition of urea liberates ammonia, which changes the colour of phenol red to
rose-pink and later to deep cerise. The reaction is often apparent after 2 h to 4 h.
Typical Salmonella cultures do not hydrolyse urea, so that the colour of the urea remains unchanged (yellow;
see Table 1).
9.5.3.4 l-Lysine decarboxylation medium (5.2.7)
Inoculate just below the surface of the liquid medium. Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Turbidity and purple colour after incubation indicates a positive reaction. A yellow colour indicates a negative reaction.
Most typical Salmonella cultures show a positive reaction (see Table 1).
9.5.3.5 Interpretation of the biochemical tests
Salmonella generally show the reactions given in Table 1. If these reactions are found it can be considered that
the sample may contain Salmonella spp.
Table 1 — Interpretation of biochemical tests; typical reactions of most Salmonella serovars
(percentages indicated in brackets)
TSI agar
yellow glucose positive (100 %)
Butt black formation of hydrogen sulfide, H S (91,6 %)
2
bubbles and/or cracks gas formation from glucose (91,9 %)
Slant surface red or unchanged lactose and/or sucrose negative (respectively 99,2 % and 99,5 %)
Urea agar
— yellow, no colour changing of the medium negative (100 %)
LDC
— purple colour and turbidity positive (94,6 %)
9.5.4 Serological confirmation and serotyping
Biochemical test results can indicate whether an isolate belongs to the genus Salmonella. For a full typing of
Salmonella strains, serotyping has also to be performed. Serological confirmation gives additional information
© ISO 2012 – All rights reserved 7
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SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 6579-2
Première édition
2012-11-01
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des
Salmonella —
Partie 2:
Dénombrement par une technique
miniaturisée du nombre le plus probable
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for the
detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 2: Enumeration by a miniaturized most probable number technique
Numéro de référence
ISO/TS 6579-2:2012(F)
©
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ISO/TS 6579-2:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préenrichissement en milieu liquide non sélectif . 2
4.3 Enrichissement en milieu semi-solide sélectif . 2
4.4 Isolement sélectif et identification . 3
4.5 Confirmation . 3
4.6 Calcul du NPP . 3
5 Milieux de culture et sérums . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Milieux de culture . 3
6 Appareillage . 4
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire . 5
9.1 Prise d’essai et suspension mère . 5
9.2 Dilution et préenrichissement en milieu liquide non sélectif . 5
9.3 Enrichissement sélectif en milieu semi-solide . 5
9.4 Isolement sélectif . 6
9.5 Confirmation biochimique et sérologique . 6
10 Expression des résultats . 8
11 Rapport d’essai . 8
Annexe A (informative) Composition et préparation de milieux de culture et de réactifs .10
Annexe B (informative) Schéma du mode opératoire .17
Bibliographie .18
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans un
groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des membres
votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS ou ISO/TS
a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa transformation en
Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 6579-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L’ISO 6579 comprend la partie suivante, présentée sous le titre général Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella:
— Partie 2: Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le plus probable [Spécification technique]
Des parties supplémentaires, traitant d’une méthode de détection et donnant des lignes directrices pour la
sérotypie, sont prévues. L’ISO 6579:2002 sera annulée ultérieurement.
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Introduction
Le mode opératoire décrit est fondé sur la méthode donnée en Référence [1].
Le mode opératoire de dénombrement décrit ici se rapporte à une technique miniaturisée du nombre le plus
probable (NPP). Pour cette technique miniaturisée du NPP sur milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis
modifié (MSRV), le volume de la première dilution soumise à essai est inférieur au volume employé dans la
[6]
méthode de détection spécifiée dans l’ISO 6579:2002 + Cor.1:2004 + Amd.1:2007 . Pour cette raison, la
sensibilité de la technique sur MSRV miniaturisé est inférieure à celle obtenue pour ces méthodes de détection
(Référence [1]). La limite de détection de la méthode sur MSRV miniaturisé est d’environ 1 ufc/g, mais peut
fluctuer d’un sérovar de Salmonella à un autre et d’une matrice à une autre. Pour les méthodes de détection
susmentionnées, la limite de détection est habituellement de 1 ufc/25 g (0,04 ufc/g). Pour les échantillons
ne comptant qu’un (très) petit nombre de Salmonella spp. (< 1 ufc/g), le mode opératoire en milieu MRSV
miniaturisé peut ne pas être suffisamment sensible. Si un résultat quantitatif est attendu pour des échantillons
susceptibles de contenir de si faibles nombres de Salmonella spp. (et testés négatifs par cette technique sur
MSRV miniaturisé, par exemple), il est conseillé de procéder au dénombrement à l’aide d’une technique du
NPP «classique» (non miniaturisée). Pour les autres échantillons, la méthode sur MSRV miniaturisé peut être
avantageuse par rapport à la technique du NPP classique du fait que la technique miniaturisée du NPP peut
prendre moins de temps et nécessite moins de ressources (en raison de faibles quantités).
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 6579-2:2012(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella —
Partie 2:
Dénombrement par une technique miniaturisée du nombre le
plus probable
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel d’effectuer
les essais de recherche de Salmonella uniquement dans des laboratoires correctement équipés, sous
la direction d’un microbiologiste compétent, et de faire très attention à l’élimination de toutes les
substances incubées.
Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien les pratiques courantes
de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de
sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques
appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité à la réglementation
nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 6579 décrit une méthode de dénombrement de Salmonella spp. présentes dans:
— les produits destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation animale;
— les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de produits
alimentaires;
— les matières fécales des animaux;
— les échantillons environnementaux au stade de la production primaire;
par le calcul du nombre le plus probable (NPP).
La méthode est fondée sur une miniaturisation des étapes de dilution, de préenrichissement et d’enrichissement
sélectif. Le milieu d’enrichissement sélectif, le milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis modifié (MSRV), est
conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n’est pas adapté à la recherche des Salmonella immobiles.
Il est possible que la méthode soit moins appropriée au dénombrement de Salmonella ser. Typhi et Salmonella
ser. Paratyphi.
La méthode n’est pas appropriée au dénombrement de Salmonella spp. présentes en (très) faibles concentrations
dans des échantillons contaminés (< 1 ufc/g).
NOTE Le nombre de Salmonella immobiles est généralement faible dans la plupart des matrices pertinentes pour la
présente méthode. Dans la présente note, des exemples sont donnés pour des échantillons provenant d’une production
primaire. Il semble que les biovars de Salmonella immobiles, les Salmonella Gallinarum (Salmonella Gallinarum biovar
gallinarum et Salmonella Gallinarum biovar pullorum), ne survivent pas longtemps dans les échantillons environnementaux,
ils sont par conséquent rarement détectés dans les échantillons de fèces ou environnementaux (poussière, par
exemple) et cela quelle que soit la méthode. Il semble que le nombre des autres sérovars de Salmonella immobiles
soit généralement faible dans les échantillons de fèces. Par exemple, en Référence [4], environ 1 000 échantillons de
fèces de poules pondeuses et environ 900 échantillons de fèces de poulets de chair ont été analysés, moins de 1 % du
nombre total d’échantillons étaient positifs en bouillon de culture sélectif et négatifs en milieu MSRV (donc susceptibles
d’être immobiles). Une étude hollandaise menée sur environ 3 200 échantillons de fèces de porcs a fourni des résultats
similaires (données non publiées). D’autre part, dans l’étude décrite en Référence [4], pratiquement 40 % des échantillons
positifs n’auraient pas été détectés («faux négatifs») si un bouillon de culture sélectif avait uniquement été utilisé (dans ce
cas, le bouillon Rappaport-Vassiliadis) à la place d’un milieu semi-solide.
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2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables à l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s’applique.
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour la préparation et la production des
milieux de culture — Partie 1: Lignes directrices générales d’assurance qualité pour la préparation des milieux
de culture en laboratoire
ISO/TS 11133-2, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
Salmonella
microorganisme formant des colonies caractéristiques ou moins caractéristiques sur des milieux solides
sélectifs et possédant des caractéristiques biochimiques et sérologiques spécifiques
NOTE Des essais appropriés relatifs aux caractéristiques biochimiques et sérologiques spécifiques sont spécifiés
dans la présente partie de l’ISO 6579.
3.2
dénombrement des Salmonella
nombre de Salmonella spp. présentes par millilitre ou par gramme d’un échantillon pour essai ou par aire d’un
objet (par exemple chausson)
4 Principe
4.1 Généralités
Le dénombrement de Salmonella spp. dans le format du NPP nécessite quatre étapes successives (4.2 à 4.5).
4.2 Préenrichissement en milieu liquide non sélectif
Préparation d’une dilution au dixième de l’échantillon dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT) (suspension mère).
Dépôt de la suspension mère dans la première rangée (vide) comportant trois puits d’une plaque de
«microtitrage» à 12 puits.
Ensemencement de la deuxième rangée de trois puits de la plaque de «microtitrage» à 12 puits, contenant un
bouillon de préenrichissement non sélectif (EPT) avec une quantité spécifiée de la première rangée.
Ensemencement des troisième et quatrième rangées de trois puits contenant de l’EPT, et si nécessaire des
rangées de plaques supplémentaires.
Incubation des plaques de «microtitrage» à 12 puits à 37 °C pendant 18 h.
4.3 Enrichissement en milieu semi-solide sélectif
Repiquage de chaque puits obtenu en 4.2 dans un puits contenant de la gélose semi-solide (MSRV).
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Incubation de la plaque de MSRV à 41,5 °C pendant 24 h. Si le MSRV est négatif après 24 h, la plaque est
incubée pendant 24 h supplémentaires.
4.4 Isolement sélectif et identification
À partir des cultures (les plus fortes dilutions) (suspectes) obtenues en 4.3, un milieu solide sélectif xylose
lysine désoxycholate (XLD) est ensemencé et incubé à 37 °C pendant 24 h.
4.5 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella isolées obtenues en 4.4 et confirmation au moyen des
essais biochimiques et sérologiques appropriés.
4.6 Calcul du NPP
Le nombre le plus probable de Salmonella spp. par millilitre ou par gramme de l’échantillon pour essai est
calculé à partir du nombre de puits confirmés positifs.
5 Milieux de culture et sérums
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218.
En ce qui concerne les essais de performance des milieux, suivre les recommandations de l’ISO/TS 11133-1,
de l’ISO/TS 11133-2 et les informations données en A.8.
Tous les milieux et réactifs nécessaires sont décrits à l’Annexe A. En alternative, il est possible d’utiliser des
milieux complets ou des diluants déshydratés. Dans ce cas, suivre les instructions du fabricant.
5.2 Milieux de culture
5.2.1 Milieu de préenrichissement non sélectif: eau peptonée tamponnée (EPT). Voir A.1.
5.2.2 Gélose d’enrichissement sélectif semi-solide: milieu semi-solide de Rappaport-Vassiliadis
modifié (MSRV). Voir A.2.
5.2.3 Gélose au xylose lysine désoxycholate (gélose XLD). Voir A.3.
5.2.4 Gélose nutritive. Voir A.4.
5.2.5 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres (gélose TSI). Voir A.5.
De la gélose au citrate de fer et aux deux sucres (Kligler-Hajna) peut être utilisée en variante.
5.2.6 Gélose à l’urée (Christensen). Voir A.6.
5.2.7 Milieu de décarboxylation de la l-lysine (LDC).
5.2.8 Antisérums
Il est possible de trouver dans le commerce plusieurs types de sérums agglutinants contenant des anticorps
contre un ou plusieurs facteurs antigéniques O et des anticorps contre un ou plusieurs facteurs antigéniques H.
Il convient de faire tous les efforts afin de s’assurer que les antisérums utilisés conviennent pour la recherche
de tous les sérovars de Salmonella.
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6 Appareillage
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave). Voir l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve ventilée, pouvant être maintenue à une température comprise entre
25 °C et 50 °C, ou hotte à flux d’air laminaire.
6.3 Étuves, pouvant fonctionner à 37 °C ± 1 °C et à 41,5 °C ± 1 °C.
6.4 Bain d’eau, pouvant fonctionner à une température comprise entre 47 °C et 50 °C.
6.5 Réfrigérateur (destiné à la conservation de milieux préparés), pouvant fonctionner à 5 °C ± 3 °C.
6.6 pH-mètre, ayant une résolution de 0,01 unité de pH et une exactitude de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
Voir l’ISO 7218.
6.7 Tubes à essai et flacons stériles, de capacité appropriée. Des bouteilles ou flacons à bouchons
métalliques ou en matière plastique (à vis) non toxiques peuvent être utilisés.
6.8 Anses bouclées, de1 µl.
6.9 Pipettes graduées stériles ou pipettes automatiques, de capacités nominales de 10 ml (graduées en
divisions de 0,5 ml), de 2 ml (graduées en divisions de 0,1 ml), de 0,1 ml (graduées en divisions de 0,01 ml).
Pipettes multicanaux de capacités nominales de 0,5 ml et de 0,02 ml pour pipeter trois puits à la fois.
6.10 Boîtes de Petri stériles, d’environ 90 mm de diamètre.
6.11 Plaques de «microtitrage» à 12 puits stériles, dont les puits ont un diamètre d’environ 25 mm et une
profondeur de 20 mm (5 ml) et présentent un fond plat et sont dotés de couvercles.
6.12 Homogénéisateur. Voir l’ISO 7218.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 6579. Se référer
à la Norme internationale spécifique concernant le produit concerné.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, non endommagé ou modifié lors du
transport et du stockage.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est
recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique appropriée au produit concerné.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.
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9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai et suspension mère
Se référer à l’ISO 6887 et à la Norme internationale spécifique appropriée au produit concerné. Préparer
la suspension mère en diluant la prise d’essai au dixième dans de l’EPT (5.2.1). Par exemple, ajouter 25 g
d’échantillon à 225 ml d’EPT et homogénéiser (6.12), par exemple dans un mélangeur à palettes, pendant 1 min.
9.2 Dilution et préenrichissement en milieu liquide non sélectif
Utiliser une plaque de «microtitrage» à 12 puits (6.11) dont les trois puits de la première rangée sont vides et
dont les autres puits sont remplis avec 2 ml d’EPT (5.2.1) (les deuxième, troisième et quatrième rangées de
trois puits chacune, voir Annexe B).
NOTE 1 En tant que cas général, le mode opératoire décrit spécifie les dilutions pour une seule plaque de «microtitrage»
à 12 puits. Lorsqu’un nombre de Salmonella supérieur à 500 ufc/g est attendu, il est nécessaire d’employer une deuxième
plaque de «microtitrage» à 12 puits contenant dans chaque puits 2 ml d’EPT (5.2.1). Préparer un nombre suffisant de
plaques (dilutions) pour s’assurer que le dernier puits dans la plaque de «microtitrage» à 12 puits donne un résultat négatif.
Remplir chacun des trois puits de la première rangée (vides) de 2,5 ml de la suspension mère (9.1), en utilisant
une pipette (6.9).
Prélever 0,5 ml (par exemple en utilisant une pipette multicanaux, 6.9) de chaque puits de la première rangée
et les ajouter aux puits de la deuxième rangée contenant 2 ml d’eau peptonée tamponnée (première dilution
au cinquième).
Prélever 0,5 ml (par exemple en utilisant une pipette multicanaux, 6.9, avec de nouveaux embouts) de chaque
puits de la deuxième rangée et les ajouter aux puits de la troisième rangée contenant 2 ml d’eau peptonée
tamponnée (deuxième dilution au cinquième).
Avant de transférer les 0,5 ml de la deuxième rangée dans la troisième rangée, mélanger les suspensions dans
les puits en répétant plusieurs fois (avec soin) la manipulation consistant à prélever la suspension à la pipette
et à l’expulser dans son puits d’origine.
Procéder de la même façon pour les rangées suivantes.
Incuber la plaque de «microtitrage» à 12 puits à 37 °C (6.3) pendant 18 h ± 2 h.
NOTE 2 Comme le niveau de contamination des échantillons soumis à essai n’est en général pas connu et est bien
souvent faible, il peut s’avérer utile de vérifier que des Salmonella spp. sont présentes dans l’échantillon en mettant en
culture la suspension mère. À cette fin, incuber la suspension mère (9.1) à 37 °C (6.3) pendant 18 h. En ce qui concerne
les étapes de culture suivantes, suivre les modes opératoires décrits de 9.3 à 9.5. En 9.3: ensemencer une boîte de Petri
contenant du MSRV avec 1 à 3 gouttes équidistantes ayant un volume total de 0,1 ml de la culture incubée à l’EPT de la
suspension mère (9.1).
9.3 Enrichissement sélectif en milieu semi-solide
Laisser le MSRV (5.2.2) dans les plaques de «microtitrage» à 12 puits se réchauffer à température ambiante
si ces dernières étaient conservées à une température inférieure.
Ensemencer chaque puits contenant 2 ml de MSRV avec 20 µl d’EPT incubé (9.2), par exemple en utilisant une
pipette multicanaux (6.9). Utiliser de nouveaux embouts pour chaque rangée de trois puits.
Déposer les 20 µl d’EPT incubé sur la surface du milieu et au bord du puits (voir Annexe B).
Lors du prélèvement d’une subculture d’EPT, essayer de ne pas remuer les agglomérats. Par conséquent,
déplacer les plaques de microtitrage avec précaution. Éviter de pipeter les particules pour ne pas les déposer
sur les plaques de MSRV.
Incuber les plaques de MSRV ensemencées à 41,5 °C (6.3) pendant 24 ± 3 h.
Ne pas retourner les plaques.
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ISO/TS 6579-2:2012(F)
Les puits suspects présentent une zone trouble blanche grisâtre s’étendant à partir de la goutte ensemencée.
La zone trouble est caractéristique quand le halo blanc présente des contours nets.
Si les puits s’avèrent négatifs après 24 h, réincuber pendant 24 h ± 3 h.
9.4 Isolement sélectif
Laisser les plaques de gélose XLD (5.2.3) se réchauffer à température ambiante si ces dernières étaient
conservées à une température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des plaques avant utilisation.
Repiquer les puits de MSRV suspects (9.3) à l’aide d’une anse de 1 µl (6.8) en piquant le front de la migration
et en ensemençant la culture sur la surface d’une seule gélose XLD coulée en boîte de Petri de taille normale,
de manière à obtenir des colonies bien isolées.
Repiquer au moins les plus fortes dilutions: les dilutions qui montrent encore trois puits de MSRV suspects de
même que les dilutions suivantes montrant deux ou un seul puits de MSRV suspects.
Incuber les boîtes de XLD, surface de la gélose vers le bas, à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Réincuber les plaques de MSRV négatives à 41,5 °C pendant 24 h ± 3 h supplémentaires. Si, après 48 h
d’incubation les puits deviennent suspects, pratiquer l’étape de l’isolement sélectif.
Appliquer le mode opératoire d’isolement sélectif si, après 48 h d’incubation supplémentaires, les puits
deviennent suspects.
Les colonies caractéristiques de Salmonella spp. cultivées sur gélose XLD ont un centre noir entouré d’une
zone transparente rougeâtre, due à un changement de couleur de l’indicateur du milieu.
NOTE Les colonies de Salmonella spp. variants H S négatif cultivées sur gélose XLD sont roses avec un centre rose
2
foncé. Les colonies de Salmonella spp. variants lactose positif cultivées sur gélose XLD sont jaunes, avec ou sans centre noir.
9.5 Confirmation biochimique et sérologique
9.5.1 Généralités
Confirmer au moins une colonie suspecte bien isolée provenant de chaque boîte de XLD (9.4). Si aucune colonie
bien isolée n’est présente, il peut s’avérer nécessaire d’effectuer une étape de subculture supplémentaire sur gélose
XLD ou sur gélose non sélective, par exemple gélose nutritive (5.2.4), afin d’obtenir des colonies bien isolées.
Si aucune Salmonella spp. n’est confirmée pour tous les puits sélectionnés, il convient de les rechercher dans
les puits de MSRV présumés qui ne sont pas encore repiqués (dans des dilutions inférieures).
Les kits d’identification, actuellement disponibles dans le commerce et permettant d’identifier les Salmonella
spp., peuvent être utilisées. Ces kits d’identification concernent l’identification biochimique des colonies. Il
convient d’utiliser ces kits en suivant les instructions du fabricant.
NOTE La reconnaissance de colonies de Salmonella spp. est en grande partie une question d’expérience et leur aspect
peut quelquefois varier, non seulement d’un sérovar à un autre, mais également d’un lot de milieu de culture à un autre.
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation
Pour la confirmation, prélever, à partir de chaque boîte de XLD (9.4) au moins une colonie considérée comme
caractéristique ou suspecte.
Si des colonies bien isolées (d’une culture pure) sont disponibles sur les milieux sélectifs (9.4), la confirmation
biochimique peut être réalisée directement sur une colonie suspecte, bien isolée, du milieu de culture sélectif.
L’étape de culture sur la gélose non sélective, comme la gélose nutritive (5.2.4), peut ensuite être effectuée
en parallèle avec les essais biochimiques de vérification de la pureté de la colonie prélevée à partir du milieu
gélosé sélectif. Incuber les boîtes de gélose nutritive ensemencées à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Utiliser des cultures pures pour la confirmation biochimique et sérologique.
...
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