ISO/TS 20836:2005
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Performance testing for thermal cyclers
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens — Performance testing for thermal cyclers
ISO/TS 20836:2005 provides basic requirements for the installation, performance and maintenance of thermal cyclers. Although thermal cyclers are robust technical equipment, they do require regular maintenance. Their cooling/heating elements have a limited lifetime. Proper functioning of the cooling/heating element depends both on the quality of the cooling/heating devices and proper use and care. In addition to outlining the requirement for a defined maintenance programme, procedures are described for the determination of thermal cycler performance by biochemical or physical methods.
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Essais de performance des thermocycleurs
L'ISO/TS 20836:2005 précise des exigences fondamentales concernant l'installation, la performance et la maintenance des thermocycleurs. Bien que ces équipements soient des dispositifs solides, ils nécessitent une maintenance régulière. Leurs éléments chauffants/refroidissants ont une durée de vie limitée. Le bon fonctionnement de l'élément chauffant/refroidissant dépend à la fois de la qualité des dispositifs de chauffage/refroidissement et d'une utilisation et de maintenances appropriées. En plus de la définition des exigences pour un programme de maintenance défini, des modes opératoires pour la détermination de la performance des thermocycleurs par des méthodes biochimiques ou physiques sont donnés.
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TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 20836
First edition
2005-08-01
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Polymerase chain reaction
(PCR) for the detection of food-borne
pathogens — Performance testing for
thermal cyclers
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) pour la recherche des micro-organismes pathogènes dans les
aliments — Critères de performance pour les thermal cyclers
Reference number
ISO/TS 20836:2005(E)
©
ISO 2005
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ISO/TS 20836:2005(E)
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Published in Switzerland
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ISO/TS 20836:2005(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Installation of thermal cyclers . 2
5 Maintenance of thermal cyclers . 2
6 Performance tests. 2
6.1 General. 2
6.2 Biochemical performance test . 2
6.3 Physical performance test . 2
7 Test report and documentation of irregularities . 3
Annex A (informative) Biochemical performance test — PCR method for testing the temperature
accuracy . 4
Annex B (informative) Physical performance test . 11
Bibliography . 13
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ISO/TS 20836:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of normative document:
⎯ an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
⎯ an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
ISO/TS 20836 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with Technical Committee ISO/TC 34,
Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
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ISO/TS 20836:2005(E)
Introduction
This Technical Specification is part of a series of International Standards under the general title Microbiology
of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne
pathogens:
⎯ General requirements and definitions (ISO 22174);
⎯ Requirements for sample preparation for qualitative detection (ISO 20837);
⎯ Performance testing for thermal cyclers (ISO/TS 20836);
⎯ Requirements for amplification and detection for qualitative methods (ISO 20838).
The International Organization for Standardization (ISO) draws attention to the fact that it is claimed that
compliance with this document may involve the use of one or more patents concerning the PCR technology.
ISO takes no position concerning the evidence, validity and scope of these patent rights.
ISO has been informed that Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffman-La Roche
Ltd. hold patent rights concerning the PCR technology. The companies have assured the ISO that they are
willing to negotiate licences under reasonable and non-discriminatory terms and conditions with applicants
throughout the world. In this respect, the statements of the holders of these patent rights are registered with
ISO. Information may be obtained from:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
USA
and
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
USA
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights other than those identified above. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent
rights.
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 20836:2005(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase
chain reaction (PCR) for the detection of food-borne
pathogens — Performance testing of thermal cyclers
WARNING — The use of this Technical Specification may involve hazardous materials, operations and
equipment. This Technical Specification does not purport to address all of the safety problems
associated with its use. It is the responsibility of the user of this Technical Specification to establish
appropriate safety and health practices and to determine the applicability of regulatory limitations
prior to use.
1 Scope
This Technical Specification provides basic requirements for the installation, performance and maintenance of
thermal cyclers. Although thermal cyclers are robust technical equipment, they do require regular
maintenance. Their cooling/heating elements, either Peltier or other technology, have a limited lifetime. Proper
functioning of the cooling/heating element depends both on the quality of the cooling/heating devices and
proper use and care.
In addition to outlining the requirement for a defined maintenance programme, procedures are described for
the determination of thermal cycler performance by biochemical or physical methods (see Annexes A and B).
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174 and the following apply.
3.1
heated lid
optional feature of a thermal cycler used to prevent evaporation from the reaction tube
3.2
temperature uniformity
homogeneity of the temperature within the thermally controlled unit (e.g. heating block)
3.3
biochemical performance test
test procedure which determines the performance of a thermal cycler by biochemical means (e.g. a
temperature-sensitive PCR)
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ISO/TS 20836:2005(E)
3.4
physical performance test
test procedure which determines the performance of a thermal cycler by physical means
3.5
non-robust PCR system
PCR system in which minor deviations from the prescribed PCR chemistry or PCR temperature protocol result
in a less efficient amplification
3.6
critical position
position or area where a deviation of the sample temperature from the displayed temperature is more likely to
occur than in other areas of the thermal cycler sample holder
4 Installation of thermal cyclers
The manufacturer’s instructions should be followed.
The following should be taken into consideration:
a) thermal cyclers should be installed and run at an appropriate temperature and humidity;
b) thermal cyclers should be located
⎯ so they can be inspected visually,
⎯ in such a way as to allow a steady exchange of heat with the environment and free circulation of air,
and
⎯ in a constant environment.
5 Maintenance of thermal cyclers
The laboratory should establish and employ a defined maintenance programme for each thermal cycler
machine, based on the documented hours of use or number of runs.
6 Performance tests
6.1 General
The performance testing of each thermal cycler should be carried out and documented, either indirectly using
a biochemical performance test or directly using a physical performance test.
6.2 Biochemical performance test
A biochemical procedure for thermal cycler performance testing should be carried out, which may be a
temperature-sensitive non-robust PCR method.
An example of a suitable method is described in Annex A. Any other PCR methods that can be shown to fulfil
the requirements may also be used.
The performance test frequency should be based on the documented hours of use or the number of runs of
each thermal cycler machine.
6.3 Physical performance test
A physical test procedure should be carried out to measure the actual sample temperature within each well
during the temperature cycle, and to compare it to the displayed temperature.
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ISO/TS 20836:2005(E)
An example of a suitable method is described in Annex B. A physical performance test should be undertaken
if a biochemical performance test is not performed, or if the biochemical performance test indicates inefficient
amplification.
The performance test frequency should be based on the documented hours of use or the number of runs of
each thermal cycler machine.
7 Test report and documentation of irregularities
The test report shall conform to ISO/IEC 17025 and should contain at least the following:
⎯ identification number of the thermal cycler;
⎯ a reference to this Technical Specification and the Annex used for the test;
⎯ the date of testing;
⎯ person responsible for the analysis;
⎯ test results;
⎯ any particular points observed during testing;
⎯ any deviation, additions to or exclusions from the test specification;
⎯ any other information relevant to the specific test.
The laboratory should have documented procedures in place to identify and address any irregularities
concerning thermal cycler performance (see also ISO/IEC 17025).
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ISO/TS 20836:2005(E)
Annex A
(informative)
Biochemical performance test — PCR method for testing the
temperature accuracy
A.1 General
This method verifies the accuracy of the control of the annealing temperature of thermal cyclers. The test is
sensitive to an increase in the real annealing temperature relative to the displayed temperature during a
defined temperature programme cycle.
A.2 Principle
The accuracy of the programmed/displayed temperature is tested using a specifically designed PCR. The
PCR samples are highly sensitive to an overshoot of the annealing temperature during the temperature cycles.
A 362 base pair (bp) DNA sequence, which contains the target site for the PCR, is generated by amplifying
the flanking region of the cloning site of the pGEM vector with a standard M13 sequencing primer pair. The
cloned sequence is shown in Figure A.1.
Figure A.1 — Template and primer sequences used in a thermal cycler performance test
The sequence of the PCR product was derived by using the M13-primers ('double'-underlined) in the PCR
1)
amplification of the target sequence from the modified pGEM plasmid (pSC17 ). The primers used in the test
system for the thermal cycler validation are highlighted and shown separately (VAL1 and VAL2, see A.3.5.3
and A.3.5.4). The sequence of the PCR product generated in this thermal cycler performance test is
underlined. A mismatch is shown in bold.
The primers VAL1 and VAL2 produce a 116 bp PCR product, which is detected by agarose gel
electroph
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 20836
Première édition
2005-08-01
Microbiologie des aliments — Réaction
de polymérisation en chaîne (PCR)
pour la recherche de micro-organismes
pathogènes dans les aliments —
Essais de performance des
thermocycleurs
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain
reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens —
Performance testing for thermal cyclers
Numéro de référence
ISO/TS 20836:2005(F)
©
ISO 2005
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ISO/TS 20836:2005(F)
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peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
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l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
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de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2007
Publié en Suisse
ii © ISO 2005 – Tous droits réservés
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ISO/TS 20836:2005(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction .v
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.1
4 Installation des thermocycleurs.2
5 Maintenance des thermocycleurs.2
6 Essais de performance .2
6.1 Généralités .2
6.2 Essai biochimique de performance .3
6.3 Essai physique de performance.3
7 Rapport d'essai et relevé des écarts .3
Annexe A (informative) Essai biochimique de performance — Méthode de PCR pour le contrôle
de l'exactitude des températures.4
Annexe B (informative) Essai physique de performance.12
Bibliographie .14
© ISO 2005 – Tous droits réservés iii
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ISO/TS 20836:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents normatifs:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 20836 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l'Accord de
coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2005 – Tous droits réservés
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ISO/TS 20836:2005(F)
Introduction
La présente Spécification technique fait partie d'une série de Normes internationales regroupées sous le titre
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments:
⎯ Exigences générales et définitions (ISO 22174);
⎯ Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative (ISO 20837);
⎯ Essais de performance des thermocycleurs (ISO/TS 20836);
⎯ Exigences relatives à l'amplification et à la détection pour les méthodes qualitatives (ISO 20838).
L'Organisation internationale de normalisation (ISO) souhaite indiquer qu'il est possible que la conformité au
présent document implique l'utilisation d'un ou plusieurs brevets relatifs aux techniques de PCR.
L'ISO ne prend aucunement position concernant la réalité, la validité et le champ d'application de ces droits
de brevet.
L'ISO a été informée que Applied Biosystems, Roche Molecular Systems, Inc. et F. Hoffman-La Roche Ltd.
détiennent des droits de brevet relatifs aux techniques de PCR. Les entreprises ont assuré l'ISO qu'elles sont
prêtes à négocier des licences aux demandeurs dans le monde entier avec des conditions générales
raisonnables et non discriminatoires. À cet égard, les déclarations des détenteurs de ces droits de brevet sont
enregistrées auprès de l'ISO. Les informations sont disponibles aux adresses suivantes:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
États-Unis
et
Roche Molecular Systems, Inc.
Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
États-Unis
L'ISO attire également l'attention sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de brevet autres que ceux indiqués ci-dessus. L'ISO ne peut être tenue responsable de
l'identification de l'un quelconque ou de la totalité de tels droits de brevet.
© ISO 2005 – Tous droits réservés v
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 20836:2005(F)
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) pour la recherche de micro-organismes
pathogènes dans les aliments — Essais de performance des
thermocycleurs
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Spécification technique peut impliquer des matériaux,
opérations ou matériels dangereux. L'objectif de la présente Spécification technique n'est pas de
couvrir tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur de la présente
Spécification technique d'établir les pratiques d'hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer
les conditions d'application des restrictions réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique précise des exigences fondamentales concernant l'installation, la
performance et la maintenance des thermocycleurs. Bien que ces équipements soient des dispositifs solides,
ils nécessitent une maintenance régulière. Leurs éléments chauffants/refroidissants, à effet Peltier ou
équivalent, ont une durée de vie limitée. Le bon fonctionnement de l'élément chauffant/refroidissant dépend à
la fois de la qualité des dispositifs de chauffage/refroidissement et d'une utilisation et de maintenances
appropriées.
En plus de la définition des exigences pour un programme de maintenance défini, des modes opératoires
pour la détermination de la performance des thermocycleurs par des méthodes biochimiques ou physiques
sont décrits (voir les Annexes A et B).
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO/CEI 17025, Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 22174 ainsi que les
suivants s'appliquent.
3.1
couvercle chauffant
élément facultatif d'un thermocycleur servant à éviter l'évaporation à partir du tube de réaction
3.2
uniformité de la température
homogénéité de la température qui règne au sein de l'unité thermiquement contrôlée (bloc chauffant par
exemple)
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ISO/TS 20836:2005(F)
3.3
essai biochimique de performance
mode opératoire d'essai qui détermine la performance d'un thermocycleur par voie biochimique
(PCR thermosensible par exemple)
3.4
essai physique de performance
mode opératoire qui détermine la performance d'un thermocycleur par voie physique
3.5
système de PCR non robuste
système de PCR pour lequel de petits écarts par rapport au protocole thermique ou chimique prescrit ont pour
résultat une amplification plus faible
3.6
espace critique
espace ou positions dans le portoir du thermocycleur où il est le plus probable que la température de
l'échantillon présentera un écart par rapport à la valeur affichée, par comparaison avec les autres positions
4 Installation des thermocycleurs
Il convient de suivre les instructions du fabricant.
Il est recommandé de prendre en considération les aspects suivants:
a) il convient d'installer les thermocycleurs de manière à les faire fonctionner à une température et à une
humidité appropriées;
b) il convient de placer les thermocycleurs:
⎯ de façon à pouvoir les soumettre à un examen visuel;
⎯ de manière à permettre des échanges de chaleur constants avec l'environnement et une libre
circulation de l'air; et
⎯ dans un environnement stable.
5 Maintenance des thermocycleurs
Il est recommandé que le laboratoire établisse et mette en œuvre un programme de maintenance défini pour
chaque thermocycleur, sur la base du nombre d'heures d'utilisation ou du nombre de cycles de
fonctionnement enregistrés.
6 Essais de performance
6.1 Généralités
Il convient d'une part, d'établir les essais de performance de chaque thermocycleur soit indirectement par le
biais d'un essai biochimique, soit directement en mettant en œuvre un essai physique et, d'autre part, de les
consigner par écrit.
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ISO/TS 20836:2005(F)
6.2 Essai biochimique de performance
Il convient d'établir un mode opératoire biochimique pour les essais de performance des thermocycleurs, telle
une méthode de PCR non robuste thermosensible.
L'Annexe A décrit un exemple de méthode appropriée. Il est également possible d'utiliser toute autre méthode
de PCR pourvu qu'il puisse être démontré qu'elle remplit les exigences requises.
Pour définir la fréquence des essais de performance, il convient de s'appuyer sur les heures d'utilisation
consignées par écrit ou sur le nombre de cycles de fonctionnement de chacun des thermocycleurs.
6.3 Essai physique de performance
Il convient de réaliser un essai physique pour mesurer la température réelle de l'échantillon à l'intérieur de
chaque puits pendant le cycle de température et de comparer la valeur ainsi obtenue à celle affichée.
L'Annexe B décrit un exemple de méthode appropriée. Il y a lieu de réaliser un essai physique de
performance si l'on n'a pas effectué d'essai biochimique de performance ou si l'essai biochimique réalisé a
indiqué une amplification inefficace.
Pour définir la fréquence des essais de performance, il convient de s'appuyer sur les heures d'utilisation
consignées par écrit ou sur le nombre de cycles de fonctionnement de chacun des thermocycleurs.
7 Rapport d'essai et relevé des écarts
Le rapport d'essai doit être en conformité avec l'ISO/CEI 17025 et il est recommandé qu'il contienne au moins
les informations ci-après:
⎯ le numéro d'identification du thermocycleur;
⎯ une référence à la présente Spécification technique et à l'Annexe mise en œuvre pour l'essai;
⎯ la date des essais;
⎯ le visa de la personne responsable de l'analyse;
⎯ les résultats d'essai;
⎯ tout point particulier observé pendant l'essai;
⎯ les écarts, ajouts ou suppressions par rapport à la spécification d'essai;
⎯ toute autre information pertinente pour l'essai considéré.
Il convient que le laboratoire utilise des modes opératoires documentés pour identifier et traiter les éventuels
écarts concernant les performances du thermocycleur (voir également l'ISO/CEI 17025).
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ISO/TS 20836:2005(F)
Annexe A
(informative)
Essai biochimique de performance — Méthode de PCR pour le contrôle
de l'exactitude des températures
A.1 Généralités
La présente méthode vérifie l'exactitude du contrôle de la température d'hybridation des thermocycleurs. Cet
essai est sensible à un accroissement de la température d'hybridation réelle par rapport à la température
affichée, pendant un cycle défini du programme de température.
A.2 Principe
L'exactitude de la température programmée/affichée est vérifiée lors d'un essai en mettant en œuvre une
PCR spécifiquement conçue. Les échantillons de PCR sont très sensibles à un dépassement de la
température d'hybridation pendant les cycles de température.
Une séquence d'ADN de 362 paires de base (pb) qui contient la séquence cible à amplifier est générée par
amplification de la région adjacente du site de clonage du vecteur pGEM avec un couple d'amorces de
séquençage M13 standard. La séquence clonée est représentée sur la Figure A.1.
Figure A.1 — Séquences de la cible et des amorces utilisées
lors de l'essai de performance d'un thermocycleur
La séquence du produit d'amplification (du produit PCR) a été obtenue en utilisant les amorces M13 (double
trait de soulignement) lors de l'amplification PCR de la séquence cible à partir du plasmide pGEM modifié
1)
[pSC17 ]. Les amorces utilisées dans le système d'essai en vue de la validation du thermocycleur sont
surlignées et représentées séparément (VAL1 et VAL2, voir A.3.5.3 et A.3.5.4). La séquence du produit de
PCR généré lors de cet essai de performance est soulignée. Un mauvais appariement est mis en évidence
par une police en gras.
Le couple d'amorces VAL1 et VAL2 engendrent un produit de PCR de 116 pb qui est détecté par
électrophorèse en gel d'agarose. En raison du mauvais appariement à l'extrémité 3' de l'amorce VAL1, la
PCR est sensible à un dépassement de la température d'hybridation par rapport à la température définie. Un
dépassement de 63 °C à 66 °C provoque une amplification moins efficace et conduit à un produit PCR
de 116 pb no
...
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